Configuración de biorreactores para densidades celulares.

En un intento por aumentar las densidades celulares, la investigación se ha centrado en trabajar hacia las condiciones óptimas de bioproceso para el cultivo de microportadores de hMSC, como el tipo y la concentración de microportadores, oxígeno disuelto, densidad de siembra celular, composición del medio (incluido el suero y libre de xeno), medio régimen de intercambio, configuración del biorreactor y estrategia de agitación, entre otros. Vale la pena señalar que, aunque estos estudios han dado como resultado un progreso significativo hacia el desarrollo de un sistema de expansión de microportadoras escalable-hMSC, todavía hay margen de mejora, particularmente dado que muchos de estos estudios solo han considerado un factor a la vez y no han considerado un enfoque multifactorial y el efecto potencial de cada parámetro sobre otros.

Del mismo modo, se han realizado numerosos estudios para investigar la capacidad de cultivar células madre pluripotentes humanas (ya sea hESC o hiPSC) en microportadores en sistemas y configuración de biorreactores de tanque agitado, y algunos estudios se centran en las células que retienen su capacidad de pluripotencia, mientras que otros buscan generar una población de células especializadas. Con las células madre pluripotentes generalmente reconocidas como un tipo de célula más difícil de cultivar incluso en sistemas de monocapa en comparación con otros candidatos a terapia celular (por ejemplo, hMSC y HSC), es alentador que las células hayan podido crecer en microportadores en condiciones de tanque agitado. Sin embargo, algunos autores señalaron que las hESC pueden inducir la diferenciación en cultivos con microportadores, lo que puede ser el resultado de las fuerzas hidrodinámicas que experimentan las células en un entorno de cultivo agitado. Sin embargo, otros estudios con células madre pluripotentes humanas no han informado de diferenciación espontánea; como tal, será necesaria una mayor investigación para identificar el verdadero efecto de las fuerzas hidrodinámicas en las células.

Al igual que con la industria biofarmacéutica, se han planteado preocupaciones sobre el efecto de estas fuerzas hidrodinámicas, en particular, los esfuerzos cortantes experimentados por las células durante el proceso de expansión. Existe la percepción de que las células de mamíferos en general son «sensibles al cizallamiento» debido a su falta de pared celular, se sugiere en algunos textos que esta percepción afectó adversamente el desarrollo del cultivo de células de mamíferos en suspensión libre. La preocupación por la sensibilidad al cizallamiento era excesiva, y la mayoría de los procesos industriales que utilizan células de mamíferos ahora emplean en la configuración de biorreactores de tanque agitado.

Esta cuestión de la sensibilidad al cizallamiento también es una preocupación dentro de la industria de la terapia celular y se cita a menudo como una desventaja cuando se utiliza un sistema de biorreactor de tanque agitado. Obviamente, como se mencionó anteriormente, dada la necesidad de retener los CQA de las células y no solo la viabilidad, se debe tener especial cuidado al considerar el efecto de las fuerzas hidrodinámicas en las células madre cultivadas en biorreactores.

El enfoque actual en la configuración de biorreactores para comprender el daño tanto a las células suspendidas libremente como a las células en microportadores se basa en una comparación del tamaño de la entidad suspendida con la microescala de turbulencia de Kolmogorov (donde la microescala de turbulencia de Kolmogorov es una estimación del tamaño de los remolinos más pequeños con precisión de orden de magnitud y es una relación entre la tasa de disipación de energía específica local y la viscosidad cinemática). Si el tamaño de la entidad es lo suficientemente pequeño en comparación con la escala de Kolmogorov, entonces no debería ocurrir daño a la célula. Para el crecimiento, la escala de Kolmogorov no debe ser menor de ∼1 / 2 a 2/3 del tamaño del microvehículo. Dado que la microescala se reduce aumentando la intensidad de la agitación, para asegurar que la microescala no sea demasiado pequeña, se ha encontrado que es mejor operar el biorreactor a la velocidad mínima requerida para suspender simplemente los dispositivos. En estas condiciones, se ha demostrado que las células mantienen su CQA durante el cultivo.

Gran parte de la investigación sobre el cultivo de células madre se ha centrado principalmente en el aspecto de expansión del proceso. Sin embargo, igualmente importante es la capacidad de recolectar las células de manera eficaz, que esencialmente requiere un enfoque de dos pasos que implica primero el desprendimiento de las células de la superficie del biorreactor y luego la separación de la suspensión celular.  Gran parte del trabajo anterior solo había recolectado muestras de mililitros para estudios de análisis y caracterización celular, y como tal, aún estaba por probarse que se podría emplear una técnica escalable para recolectar con éxito las células. En resumen, basándose en conceptos teóricos subyacentes de configuración de biorreactores desarrollados para la nucleación secundaria debido a la agitación, se puede demostrar que los aumentos en la velocidad del agitador aumentan en gran medida las tensiones que separan las células. Esto conduce a su rápido desprendimiento (en aproximadamente 7 minutos) pero una vez desprendidos, las células son significativamente más pequeñas que la escala de Kolmogorov. Por lo tanto, la recolección implicó aumentar cinco veces la velocidad de agitación en comparación con la utilizada durante el cultivo en presencia de un reactivo de disociación para eliminar las células de la superficie y, posteriormente, una etapa de filtración para separar la suspensión unicelular de la suspensión del microvehículo. Se obtuvo una eficiencia de recolección de> 95% utilizando este método y, a pesar del aumento de cinco veces en la velocidad de agitación, las células recolectadas fueron viables y conservaron los atributos de calidad clave que describen el potencial de recolectar células en cantidad y calidad suficientes. Esta técnica se ha utilizado para recolectar tres líneas celulares de donantes diferentes utilizando dos microportadores diferentes en cada caso, manteniendo las células sus CQA. Dadas las teorías subyacentes involucradas en este enfoque, el protocolo también es esencialmente escalable.