Los sistemas de biorreactores con tanques de acero que permiten simular variables in vivo en un entorno in vitro controlado supusieron un gran avance en la ingeniería de tejidos. Sin embargo, debido a las características dinámico-mecánicas que presentan algunos tejidos, las estructuras diseñadas en 3D a menudo no alcanzan las propiedades biomecánicas de los tejidos nativos.
Por lo tanto, un enfoque exitoso no solo debe lograr la reparación del tejido, sino también restaurar su función después de una lesión.
Aquí describimos un método innovador para mejorar la actividad celular en andamios 3D dentro de un sistema de biorreactor dinámico, a través de la aplicación combinada de compresión mecánica y flujo de fluidos.
La Importancia del Estímulo Mecánico en 3D
La ingeniería de tejidos surgió como una alternativa para crear la arquitectura de tejidos bioartificiales in vitro mediante la implantación de células en andamios (scaffolds) 3D. Un factor clave es la aplicación de estímulos mecánicos durante la maduración para que el tejido naciente alcance una actividad funcional similar a la natural.
En este contexto, los sistemas de biorreactores han cobrado un interés especial, ya que permiten producir estructuras de tejido que son clínicamente efectivas.
- Se ha demostrado que la compresión mecánica en condiciones estáticas es perjudicial para el crecimiento celular.
- En contraste, la compresión dinámica promueve la actividad celular.
Un biorreactor debe cumplir dos requisitos esenciales para ser exitoso:
- Intensificar la transferencia de masa mediante estrategias de perfusión que generen un entorno dinámico, promoviendo la proliferación y diferenciación celular.
- Someter el tejido a cargas fisiológicamente relevantes que aceleren la producción de matriz extracelular in vitro.
Además de la difusión de nutrientes, el flujo de fluidos induce un esfuerzo cortante (shear stress) que da lugar a construcciones 3D con mayor resistencia que las desarrolladas sin estimulación mecánica. De esta manera, estos estímulos pueden actuar como antagonistas de enfoques más costosos que a menudo utilizan factores de crecimiento.
Compresión y Dinámica de Fluidos: Una Combinación Ganadora
Un método de estimulación mecánica más directo utiliza sistemas de biorreactores de compresión (uniaxial a multiaxial). Aunque aún no existen protocolos de carga estandarizados que faciliten la comparación, los parámetros de carga dinámica son cruciales:
- Amplitud
- Frecuencia
- Duración de la carga
Por ejemplo, una carga compresiva intermitente es más eficiente que una continua, ya que el período de descanso permite a las células responder al estímulo mecánico.
El método que describimos a continuación se centra en la aplicación de dos modos de estimulación en tiempo real: carga compresiva y dinámica de fluidos. Ambos, aplicados simultáneamente y con los parámetros elegidos, proporcionan un entorno que mejora la actividad celular en andamios 3D en comparación con los cultivos estáticos estándar.
Protocolo Detallado del Biorreactor
El tipo de célula y el material del andamio (biomateriales naturales o sintéticos) deben elegirse según la aplicación. El método aquí descrito hace referencia a parámetros probados en poliuretano modificado para la ingeniería de tejido cartilaginoso.
A. Componentes Esenciales
Todos los procedimientos deben seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL).
- Biorreactor ElectroForce: Conectado a una bomba peristáltica y ensamblado a celdas de carga de 22N. Posee cuatro módulos de fuerza, cada uno conectado a una cámara.
- Medio de Cultivo (DMEM): 180 mL suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos por cada cámara (la composición puede variar según el tipo de célula).
- Tubos de Bomba de PVC de 3 vías (ajuste hermético).
- Llaves de paso de tres vías conectadas a los tubos de la bomba.
- Filtros de jeringa de 0,22 μM.
- Incubadora de cultivo celular lo suficientemente grande para alojar todo el sistema del biorreactor, conectada a suministro de de CO2.
B. Preparación Previa de Muestras
- Esterilizar los andamios: Utilizando métodos que respeten sus propiedades fisicoquímicas (autoclave o baño UV-C son comunes). Para materiales sensibles al calor, se sugiere la desinfección con baños de alcohol seguidos de lavados en solución salina, ambos bajo vacío.
- Siembra celular: Sembrar los andamios con el tipo de célula deseado.
- Precápsula estático: Mantener los andamios en condiciones estáticas durante 4 días siguiendo procedimientos estándar. Este periodo es crucial para el anclaje celular y la síntesis inicial de matriz, mejorando la mecano-transducción posterior.
C. Montaje en el Biorreactor
Transferir las muestras a las cámaras del biorreactor bajo un flujo laminar estéril, con extremo cuidado para evitar daños en las células.
- Retirar la placa de sellado acrílico de la cámara y montar el sistema de tubos de flujo en las válvulas de entrada y salida.
- Añadir 180 mL de medio DMEM y eliminar todas las burbujas de aire del sistema de tubos.
- Colocar el andamio entre las columnas con pinzas. Acoplar la columna superior lo suficiente sin apretar.
- Colocar y enroscar firmemente la placa de sellado acrílico.
- Colocar la cámara en su soporte y alinear las columnas cuidadosamente.
- Añadir un filtro de jeringa de 0,22 μM a la abertura superior para contactar el aire restante en la cámara.
- Colocar la cámara ensamblada en el sistema del biorreactor.
D. Configuración de Parámetros Dinámicos
Es fundamental realizar pruebas previas sin células para asegurar que los parámetros cumplan con las propiedades mecánicas del material.
- Establecer la ruta del flujo de fluidos (idealmente a través de las columnas superior e inferior para evaluar el flujo directo a través del andamio).
- Configurar la bomba peristáltica para un flujo continuo de 0,4 mL/min.
- Montar la celda de carga según el rango de fuerza deseado (ver manual).
- Configurar los parámetros de carga:
- Valor de Fuerza: 1 N (Sistema configurado para un desplazamiento sinusoidal hasta detectar esta fuerza, garantizando una comparación homogénea).
- Frecuencia: 0,015 Hz.
- Duración: 1 hora continua.
- Duración máxima: 18 horas.
- Nota: La fuerza de 1 N se aplicó 3 veces al día, cada vez durante 1 hora, con un descanso de 1 hora sin restricciones entre cada nueva aplicación.