Ventajas del uso de biorreactores de tanque agitados instrumentados

Recientemente, el campo está llegando a un consenso de que el cultivo en suspensión 3D tiene un gran potencial para lograr los requisitos extensivos de número de células para la producción y diferenciación de hPSC mediante la optimización sistemática del proceso y el aumento de escala. En este sentido, los biorreactores de tanque agitado totalmente equipados proporcionan numerosas ventajas para el desarrollo de procesos eficientes de cultivo en suspensión, que son las siguientes:

1. La agitación controlada por impulsor asegura una mezcla y distribución homogénea de células, nutrientes y gases en todo el cultivo.

• El diseño del impulsor y la velocidad de agitación, además de la densidad de inoculación celular, permiten el control de la agregación celular y el desarrollo de agregados.

• Los reactores de tanque completamente instrumentados (a diferencia de los matraces giratorios simples) permiten monitorear y, lo que es más importante, controlar y modular los parámetros clave del proceso, incluido el pH, el OD y el monitoreo potencialmente en línea de la biomasa viable. Herramientas de proceso adicionales, por ejemplo, para el monitoreo en línea de parámetros metabólicos, se establecen fácilmente para biorreactores más grandes. Actualmente, se están desarrollando herramientas avanzadas para evaluar y controlar mejor las características específicas de las células madre, como el monitoreo no invasivo sin etiquetas de la pluripotencia de las células frente a la diferenciación y la microscopía 3D automatizada de agregados de células suspendidas y es probable que se implementen en biorreactores agitados en un futuro próximo.

• Los puertos respectivos permiten el muestreo simple y regular de células y medios para un análisis adicional fuera de línea.

• Los puertos de entrada y salida en combinación con respecto a los sistemas de retención de células permiten un rendimiento medio constante, lo que permite estrategias de alimentación más flexibles y controladas. Esto permite, por ejemplo, aplicar la alimentación por perfusión, que tiene ventajas sustanciales en comparación con la alimentación por lotes típica mediante un solo bolo medio aplicado típicamente en cultivo de tejidos 2D y para reactores convencionales de matraz giratorio.

• Los sistemas de biorreactores de tanque paralelos a pequeña escala que consisten en numerosos recipientes controlados y monitoreados de forma independiente apoyan el desarrollo del proceso multiparamétrico; la disponibilidad de sistemas de reactores más grandes físicamente equivalentes apoya posteriormente el aumento de escala del proceso lineal relativo.

• Los recipientes de cultivo desechables que cumplen con las GMP y que están disponibles en la mayoría de las dimensiones del proceso permiten la traducción clínica.

Debido a estas ventajas, la tecnología de los reactores de tanque agitado se utiliza ampliamente en las industrias biotecnológicas para la optimización y posterior producción en masa de proteínas recombinantes y vacunas a partir de líneas celulares de mamíferos establecidas como células CHO, HeLa y HEK293, por lo que los procesos establecidos en> 1000 l Se han establecido reactores a escala. Sin embargo, los respectivos bioprocesos tienen como objetivo la producción de productos derivados de células, como proteínas o vacunas, únicamente, prestando una atención limitada a las características biomédicas de las células. Este enfoque está en marcado contraste con la producción prevista de células madre y sus progenies para las terapias celulares. Debido a las condiciones de cultivo relativamente complejas para las CEP (así como para otros tipos de células madre como las CMM y las células madre hematopoyéticas (CMH)) en el estado pluripotente y el régimen de diferenciación, a menudo aún más laborioso, necesario para la derivación de la mayoría de tipos de células específicas El procesamiento de PSC en reactores de tanque agitado está todavía en su infancia.

Debido a esta complejidad, las dimensiones del proceso actual se centran en ensayos de optimización de escala de 100 ml, como máximo. Los altos costos de los medios de diferenciación y cultivo específicos de células madre, que a menudo incluyen componentes sujetos a variación de lote a lote, como la albúmina de suero bovino (BSA) o humano (HSA), ralentizan aún más este campo de investigación.

Finalmente, la transición del cultivo de hPSC 2D establecido hacia la suspensión agitada ha sido un desafío debido a las características inherentes de las células, como se describe con más detalle en las siguientes secciones.

Las mESC, que se establecieron en 1981 y, por tanto, mucho antes que las hESC de 1998, así como las iPSC de ratón / humano en 2006/2007, se utilizaron inicialmente como modelo para el desarrollo del proceso de PSC. y ampliación.

Está bien establecido que las mESC se pueden cultivar como agregados celulares al menos para la inducción de la diferenciación, que luego se denominaron cuerpos embrioides (EB) debido a su potencial de diferenciación multilinaje. Los primeros trabajos mostraron que la inoculación de mESC como células individuales en cultivo en suspensión seguido de una condición dinámica (es decir, rotación o agitación) apoya la formación de EB más homogéneos en comparación con los controles estáticos, que inducen una fusión celular y agregada perjudicial. Estas observaciones condujeron primero a procesos para la expansión de masa combinada y la diferenciación de mESCs en biorreactores totalmente instrumentados y agitados en una escala de 2000 ml. Es importante destacar que este trabajo demostró que la agregación de mESC se puede controlar mediante las condiciones de agitación, es decir, la velocidad de agitación. Utilizando líneas de mESC diseñadas por ingeniería, estos estudios también demostraron la inducción de un rendimiento celular relativamente alto de ~ 1 × 107 mESC ml − 1 durante una fase combinada de expansión y diferenciación celular. 

Además, se demostró la producción exitosa de hasta ∼109 CM murinas en un solo ciclo de biorreactor a escala de 2000 ml, por lo que el enriquecimiento genético permitió> 99% de pureza de CM. Se logró una mayor optimización del proceso mediante la transición de la alimentación por lotes a la perfusión y dio como resultado un aumento de ~ cinco veces en el rendimiento de CM, lo que permitió cosechar hasta 4,6 × 109 CM en una sola corrida de biorreactor a escala de 2000 ml. Sin embargo, estos primeros experimentos con mESC se basaron en el uso de medios de cultivo complementados con suero de ternero fetal (FCS), rico en mitógenos y pobremente definido. También debe tenerse en cuenta que las mESC tienen una tasa de proliferación significativamente mayor, lo que corresponde a un tiempo de duplicación de la población (TFD) tres veces más corto de 12-16 h en comparación con ~ 36 h para las hESC. Además, a diferencia de sus homólogos humanos, las PSC de ratón también son menos sensibles con respecto a la viabilidad de las células después de la disociación, lo que favoreció la inoculación del proceso de cultivo mediante suspensiones de células individuales para el control posterior de la agregación celular en biorreactores agitados.