Biorreactores – Uso de un BRoC como quimiostato de una sola célula

Los quimiostatos también se han utilizado para medir la dinámica en bacterias individuales, observando el crecimiento celular y la expresión de GFP mientras se mantiene una población bacteriana de la misma edad. La principal ventaja del aislamiento celular es la capacidad de estudiar células individuales en ausencia de comunicación. Sin embargo, existe la necesidad de tener un suministro continuo de nutrientes a las células aisladas y se debe eliminar el exceso de células del sistema para mantener una densidad de población en estado estacionario. Las células se cultivaron en surcos de tal manera que las células parentales se eliminan del canal en ambos extremos por los medios que fluyen. Estos quimiostatos unicelulares pueden fabricarse en agarosa fundida contra un molde intermedio de PDMS (litografía suave) con surcos submicrométricos. La agarosa tiene numerosos beneficios: menos estrés mecánico en las células, un entorno de nutrientes más uniforme y un mejor intercambio de pequeñas moléculas entre las células, en comparación con un sustrato PDMS. Se podría usar un sistema como el quimiostato de células individuales para optimizar el cultivo bacteriano seleccionando aquellas células con las mejores propiedades para la tarea en cuestión. Otros sistemas unicelulares incluyen microcavidades que permiten una célula por cavidad, sin embargo, las barreras físicas pueden afectar el comportamiento celular y pinzas ópticas que permiten estudiar, por ejemplo, el movimiento quimiotáctico de una sola E. coli. Sin embargo, un rayo láser enfocado plantea algunas preocupaciones sobre el calentamiento local y el fotodaño por irradiación a la estructura celular. El análisis de crecimiento ha demostrado que el tiempo de duplicación en los sistemas unicelulares es de alrededor de 42 minutos, mientras que en general esto es de aproximadamente 60 minutos para E. coli, ya que las células individuales no se ven afectadas por la señalización a nivel de la población o la acumulación de células.

Células de mamíferos en el biorreactor de chip

Los dispositivos microfluídicos se prestan bien para cultivos de células de mamíferos. El aumento de los dispositivos microfluídicos con cultivos de células de mamíferos servirá como un vínculo invaluable entre los modelos in vitro e in vivo, y así reducirá el número de estudios en animales y los costos para desarrollar nuevos medicamentos.

Solo uno de cada diez medicamentos que ingresan a los ensayos clínicos alcanza la etapa de aprobación. La razón principal de este fracaso es la imprevista falta de eficacia y toxicidad. Como tal, existe la necesidad de mejorar los ensayos in vitro para predecir la eficacia y la toxicidad de los fármacos candidatos. El «estándar de oro» todavía es evaluar la toxicidad y la eficacia del fármaco basado en células en placas de micropocillos. Sin embargo, la previsibilidad de tales ensayos no es satisfactoria ya que no representan el cuerpo humano en ningún aspecto; solo se cultiva un solo tipo de célula a la vez, sin considerar la típica interacción célula-célula encontrada en los tejidos. En las placas, las células tienen una configuración 2D, mientras que en los tejidos, las células están rodeadas por un ECM y otras células de soporte. Además, el microambiente que rodea los cultivos celulares 2D en placa carece de transporte de nutrientes, estrés por cizallamiento, señalización química y mecánica que se encuentra en los tejidos. Esta morfología 2D no refleja el estado in vivo de las células en 3D, ya que tiene una expresión diferente en 142 genes, alterando la función y respuesta de la célula. Esto significa que los cultivos de células 2D se comportarán intrínsecamente de manera diferente a los cultivos de células 3D, lo que también explicaría el hecho del fracaso del fármaco en ensayos clínicos en humanos. Por lo tanto, los cultivos de células 3D ofrecen un entorno más in vivo en comparación con el 2D, tanto para células de mamíferos como microbianas. La tecnología microfluídica permite la implementación de un cultivo tridimensional (3D), que puede imitar el estado in vivo de las células. Otro método para crear un entorno 3D es encapsular las células en hidrogeles.

Un aspecto de los cultivos de células 3D, que no debe pasarse por alto, es el transporte limitado de nutrientes dentro y fuera del cultivo. Después de unos días (3 días) de cultivo, el cultivo celular 3D es una estructura densa de células y ECM. El transporte difusivo es predominante dentro de la matriz celular 3D, donde a menudo los nutrientes y el oxígeno no pueden llegar al centro del cultivo. Esto causa necrosis celular en el centro del cultivo celular 3D. Para superar este problema, una solución es limitar el tamaño del cultivo celular 3D. Una cultura con una distancia de 100 μm desde el borde de la cultura hasta el centro puede mantenerse. El concepto central aquí es mantener un estado similar al tejido mediante el uso de transporte de masa microfluídica que imita la microvasculatura del tejido. Aquí es donde la microfabricación puede ayudar. La característica clave es tener una cámara celular estrecha (<200 μm de ancho), que está expuesta al medio a través de paredes porosas. Se ha fabricado una serie de micropilares, flanqueados por un canal de alimentación media en ambos lados. Otro método fue fabricar una barrera microfluídica microporosa que formara una bolsa de tamiz para recoger las células durante la siembra. Se mantuvo un flujo medio alrededor del bolsillo de la celda. Estos dispositivos de cultivo celular 3D son cultivos celulares de alta densidad (> 2000 células mm − 2), a diferencia de las suspensiones celulares. El uso de trampas microfluídicas también puede controlar los cultivos 3D. Una trampa facilita la captura de células y, como tal, la agregación al tiempo que ofrece un intercambio eficiente de nutrientes y gases. El tamaño de la trampa determina el tamaño del esferoide formado. Otras formas de controlar el tamaño del esferoide incluyen una agregación forzada centrífuga o el uso de plantillas adhesivas microfabricadas.

El mantenimiento o incluso el aumento de las funciones celulares se obtiene mediante cultivos celulares en 3D y los factores solubles apropiados. Otro enfoque para aumentar las funciones celulares es por cocultivos. Por ejemplo, cuando los hepatocitos primarios se cultivan conjuntamente con células no parenquimatosas, hay un aumento significativo en las funciones de los hepatocitos en comparación con un monocultivo de hepatocitos. Además, en cocultivos, un cultivo perfundido tiene tasas de producción metabólica significativamente más altas en comparación con los cocultivos estáticos. En el caso de un cocultivo de hepatocitos humanos y células no parenquimatosas, los hepatocitos expresaron canalículos biliares después del cuarto día de cultivo.

La integración de las técnicas convencionales de cultivo celular con la tecnología de microfabricación dio como resultado «células en un chip». Con la microfabricación, es posible reproducir sistemas multiorgánicos con circulación sanguínea, el llamado «cuerpo en un chip». Teniendo en cuenta los cultivos de células 3D, tales sistemas pueden imitar sistemas in vivo de manera más realista. Como tal, ha habido un aumento en los sistemas microfluídicos de cultivo celular en 3D y el cribado de toxicidad de fármacos, especialmente con hepatocitos. Mediante el uso de generadores de gradiente, es posible obtener un valor para el IC50 en una ejecución del sistema. Además, el uso de matrices de 20 × 50 con células encapsuladas en hidrogel podría producir resultados de ensayos de toxicidad de manera de alto rendimiento con valores de CI50 comparables a la tecnología convencional de 96 pocillos.