Biorreactores y producción de hPSC
Ampliando la discusión sobre biorreactores en la producción de hPSC en el estado pluripotente, proporcionamos un breve estado de la diferenciación cardiomiogénica ascendente de las PSC. Esto no solo refleja la propia experiencia y conocimientos, sino que también representa uno de los campos más avanzados en la producción en masa de hPSC, lo que refleja el enorme potencial terapéutico y socioeconómico de esta investigación.
En general, se pueden subdividir los procesos de producción secuenciales frente a los integrados. La producción secuencial se refiere al procesamiento independiente de células en estado pluripotente en el primer paso, que luego se diferencian en un segundo enfoque, bastante diferente. Esto podría incluir, por ejemplo, la transición del cultivo 2D para la expansión celular a la diferenciación 3D. Tradicionalmente, las estrategias de expansión celular (descritas anteriormente) se han desarrollado y optimizado independientemente de los protocolos de diferenciación. Por el contrario, el procesamiento integrado tiene como objetivo el desarrollo de enfoques de «un solo paso» estrechamente conectados basados en la transición directa de la producción de hPSC en biorreactores a la diferenciación de linaje. Esto podría establecerse cambiando medios específicos, únicamente, que controlan los diferentes pasos del proceso, pero sin una gran adaptación del entorno del biorreactor.
Para establecer condiciones de cultivo definidas químicamente y reducir significativamente los costos, se probaron moléculas pequeñas como el compuesto SB203580, un potente inhibidor de p38 MAPK. La suplementación de SB203580 a los EB diferenciados en cultivo en suspensión a escala de cultivo tisular resultó en una inducción de hasta un 10% de CM a partir de hESC de una manera dependiente de la concentración, lo que permitió el enriquecimiento a> 99% de pureza mediante selección genética.
Más recientemente, se logró una inducción de cardiomiocitos> 80% a partir de las líneas hESC y hiPSC mediante el uso del inhibidor de GSK3𝛽CHIR99021 que desencadena la activación de la vía WNT. Posteriormente, el protocolo emplea la suplementación de inhibidores químicos de la vía de WNT como IWP o IWR en etapas posteriores, lo que refleja un patrón de actividad de WNT bifásica conocido por el desarrollo del corazón. Inicialmente, el protocolo se desarrolló en un formato de monocapa 2D para la expansión y diferenciación de hPSC, lo que limita su aplicación al aumento de escala en reactores agitados.
Para superar estas limitaciones, hemos establecido recientemente una plataforma multipocillo para el cultivo y la diferenciación de hPSC en placas de 12 pocillos de baja adherencia para facilitar la optimización del proceso en un mayor rendimiento. Al mostrar que la inducción cardíaca dependía estrechamente del paso de tratamiento transitorio de CHIR99021, el trabajo permitió la combinación directa de la expansión de hPSC de agregados inoculados de células individuales con la posterior diferenciación cardíaca en un proceso integrado de “un solo paso”. La ampliación a matraces Erlenmeyer rotados en una escala de 20 ml confirmó la solidez del protocolo y la aplicabilidad a varias líneas establecidas de hESC y hiPSC y apoyó la transición final a reactores de tanque instrumentados y agitados. El proceso integrado en una escala de 100 ml permitió combinar directamente la expansión de hPSC basada en agregados, inoculada en una sola célula, seguida de la inducción de hasta un 85% de CM puros en medios definidos, lo que permite la producción de 40-50 millones de CM en una sola ejecución de proceso. También se aceptó recientemente para su publicación una descripción detallada del procedimiento experimental que incluye todos los pasos para la configuración, calibración y resolución de problemas del biorreactor.
Con su eficiencia actual, el proceso en Biorreactores de producción de hPSC podría escalarse potencialmente hasta 2000 ml para la producción de ∼1 × 109 CM humanas en un solo lote, que se ha discutido como una dosis celular terapéutica apropiada para reemplazar la pérdida de CM inducidas por IM. Curiosamente, este rendimiento calculado refleja de cerca nuestros resultados anteriores logrados para la expansión de mESC y la diferenciación cardíaca que demuestra la producción de 1 – 5 × 109 CM, en biorreactores a escala de 2000 ml. Sin embargo, un trabajo reciente sobre la diferenciación cardíaca de hPSC en un reactor de tanque totalmente equipado mostró que las modificaciones del proceso, por ejemplo, mediante el control de OD, pueden aumentar sustancialmente el rendimiento de CM, lo que sugiere un gran potencial de optimización futura.
Tomados en conjunto, el estado actual en el campo del procesamiento de PSC sugiere que el cultivo en suspensión en biorreactores instrumentados tiene un gran potencial para el desarrollo de procesos a escala clínica e industrial, pero aún se requieren avances significativos y pasos de ampliación.
Más allá de modificar la densidad de inoculación, la velocidad de agitación y la concentración de oxígeno, hasta donde sabemos, todavía no se han publicado parámetros de proceso significativos, como el control del pH mediante ciclos de retroalimentación automatizados, para el procesamiento de hPSC.