Interacciones en biorreactores con pasos cromatográficos

La integración del biorreactor de procesos ha sido reconocida durante mucho tiempo como un camino prometedor para reducir costos y mejorar el rendimiento en la producción de productos biológicos.

Kumar et al. presentaron una integración del biorreactor y el paso de captura del producto para la producción de uroquinasa a partir de cultivos celulares animales.

En este estudio, se utilizó una columna continua de criogel de poliacrilamida supermacroporosa para proporcionar un andamiaje para el crecimiento y la proliferación de células dependientes del anclaje y, al mismo tiempo, como adsorbente para la captura del producto de uroquinasa.

Se utilizaron las líneas celulares de fibrosarcoma humano HT1080 y cáncer de colon humano HCT116. Una indicación del valor del doble papel desempeñado por la columna de criogel se ofrece mediante la comparación directa que los autores hicieron del sistema actual con integración de un biorreactor estándar seguido de una columna cromatográfica.

Se descubrió que este último se obstruía rápidamente con los restos celulares, mientras que el primero funcionaba de manera efectiva sin necesidad de un paso de recolección de células intermedio.

El uso de estrategias de recolección de productos inmediatas es bastante común en los cultivos de células vegetales; un ejemplo típico lo proporciona Gao et al., quienes informaron mejoras significativas en la recuperación del producto taxiyunnanina C de suspensión de cultivos de Taxus chinensis a través de la adsorción in situ.

Combinaron esta adsorción con una elicitación repetida con un análogo de jasmonato y una estrategia de alimentación de sacarosa optimizada en bioreactores con tanques de acero.

Los mejores resultados obtenidos, aproximadamente 1.7gl⁻¹, representaron más del doble del valor más alto previamente reportado en la literatura. Se encontró que más del 90% del producto generado se adsorbió a las resinas XAD utilizadas, lo que también simplificó el posterior procesamiento.

La adsorción en lecho expandido (EBA) se ha utilizado en el pasado, más comúnmente con funcionalidad de intercambio iónico, para intentar alimentar directamente el caldo celular en una columna cromatográfica, eliminando así los pasos de clarificación. Kelly et al. recientemente investigaron adsorbentes de EBA de alta densidad de partículas de próxima generación, incluyendo dos resinas de modo mixto, para la captura directa de una proteína recombinante expresada en levadura a altas densidades celulares.

Utilizando la resina más retentiva, Fastline® MabDirect, se encontró una unión competitiva de proteínas no objetivo, y la adsorción de un caldo celular que contiene 5-10% de células redujo la capacidad de unión de equilibrio en un 30% a 50 mg ml−1 de lecho asentado.

El proceso fue aproximadamente comparable a bajas tasas de flujo con un proceso convencional que utiliza lechos empaquetados en términos de rendimiento de paso y niveles de HCP, pero eliminó sustancialmente menos ADN (alrededor de 50 veces menos que el proceso convencional).

A medida que las densidades celulares y la complejidad estructural de los productos proteicos aumentan, la clarificación puede volverse más costosa y llevar más tiempo; por lo tanto, la EBA puede resultar económicamente atractiva.

Genuinas interacciones de múltiples pasos: Hay escasez de datos experimentales en la literatura sobre la evaluación combinada de los pasos de cultivo celular y el pulido cromatográfico, sin duda debido a la complejidad de tales experimentos. Sin embargo, dichos datos ayudarían a evaluar si el óptimo global (por ejemplo, para la productividad general) para la secuencia es sustancialmente diferente de la combinación de los óptimos individuales para cada paso.

Recientemente se ha simulado esta situación para un producto con cinco especies sialiladas para la secuencia en la integración de un biorreactor de alimentación por lotes y dos columnas cromatográficas de pulido.

(Se asumió que los pasos intermedios de clarificación y captura no afectaban sustancialmente la distribución de glicofórmas.) Se supuso que el cultivo celular producía una distribución uniforme o simétrica de formas sialiladas, como primera aproximación.

El orden de elución del producto de las columnas de pulido de intercambio catiónico (CX) e interacción hidrofóbica (HIC) se invirtió: la especie más sialilada fue la más retenida en la columna CX, al ser la más cargada negativamente, y la menos retenida en la columna HIC por la misma razón.

(Se supone que estas cargas sialil juegan un papel crítico en la configuración de unión asumida por la proteína en ambos adsorbentes.) Simulaciones detalladas del proceso llevaron a la comparación de las secuencias HIC-CX y CX-HIC para las diferentes distribuciones sialiladas para cuatro parámetros operativos en cada paso cromatográfico: carga, velocidad de flujo, pendiente del gradiente y nivel inicial del modulador.

(De hecho, todo el material combinado de la primera columna se alimentó en la segunda columna, eliminando así el parámetro de carga como variable independiente para la segunda columna; esto resultó en siete variables independientes para la secuencia de pulido de las dos columnas). Las interacciones resultaron ser bastante complejas y condujeron a ventanas de operación complejas en los parámetros de operación.

Se consideraron varias funciones objetivo: rendimiento, pureza, cantidad de producto aceptablemente puro recuperado, capacidad de procesamiento y la relación molar de ácido siálico (relación de ácido siálico a relación de proteína), y se construyeron gráficos de Pareto para la optimización multicriterio.

Estos resultados se compararon con los resultados análogos para funciones objetivo escalarizadas, por ejemplo, combinando muchas o todas las funciones objetivo individuales en un solo producto ponderado (un enfoque que es bastante común como cálculo de caso base en la optimización multicriterio).

El resultado central fue, como era de esperar, que la calidad del producto era tan importante como su cantidad, y que existían condiciones en las que sería ventajoso reducir la tasa de formación del producto para mejorar su calidad.