Medición DOT y pH en biorreactores

El DOT y el pH de un caldo de cultivo representan dos de los parámetros de proceso más importantes en los cultivos biológicos. Los parámetros son indispensables para una caracterización fundamental de los bioprocesos. Para los matraces de agitación, se han informado puntos del sensor DOT autoclavables para mediciones de fluorescencia óptica. Estos sensores contienen un tinte de luminiscencia sensible al oxígeno. La concentración de oxígeno se determina mediante mediciones de por vida del luminóforo. Un desafío de la medición de DOT en el matraz de agitación es que las manchas tienen que estar cubiertas continuamente por medio de cultivo para evitar errores de medición. En particular, a altas frecuencias de agitación y bajos volúmenes de llenado, no hay una ubicación en el matraz que esté continuamente cubierta por el líquido a granel giratorio. Existen puntos de sensores similares para mediciones DOT en placas de microtitulación. La señal de fluorescencia se detecta de forma no invasiva mediante un cable de fibra óptica. En las placas de microtitulación, el líquido comúnmente cubre el fondo total durante la agitación. Potzkei desarrolló otro sensor para la medición de oxígeno en células vivas.  Este sensor se basa en la transferencia de energía de resonancia de Förster codificada genéticamente (FRET). Consiste en una fluorescente amarilla y una proteína fluorescente basada en el mononucleótido flavina (YFP-FbFP). Si hay oxígeno presente, se forma y madura YFP. En consecuencia, la intensidad de fluorescencia de FbFP medida disminuye debido a una transferencia de energía no radiactiva entre los cromóforos de FbFP y YFP. El sensor se aplicó con éxito para el monitoreo continuo en tiempo real de los cambios temporales de los niveles de O2 en el citoplasma de las células de E. coli durante un cultivo por lotes.

Para las mediciones de pH, hay disponibles sensores similares para matraces de agitación y placas de microtitulación. Las manchas se basan en la medición de fluorescencia y contienen un tinte fluorescente sensible al pH. El rango de medición del pH óptico está limitado a un rango de pH = 4.5 – 8.5. En la literatura se describe un dispositivo comercial para mediciones en línea de DOT y pH en matraces de agitación. Badugu y col. desarrolló una película de sensor de pH óptico radiométrico para bioprocesos, que puede miniaturizarse fácilmente. Es aplicable en placas de micropocillos y microbioreactores. El sensor se basa en un derivado de alilhidroxiquinolinio copolimerizado con polietilenglicol. Tiene dos máximos de excitación a 𝜆ex, 1 = 375 nm y 𝜆ex, 2 = 425 nm con un pico de emisión único a 𝜆em = 520 nm y puede usarse para determinar los valores de pH en el rango de pH = 5-8. La respuesta de pH de este sensor no es sensible a la fuerza iónica y la temperatura del medio.

Un método técnicamente simple para determinar el pH en soluciones acuosas en biorreactores es el uso del colorante fluorescente HPTS (sal trisódica del ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico). HPTS es soluble en agua y se puede agregar a una solución acuosa. Dependiendo del pH prevaleciente, cambia la intensidad de fluorescencia de HPTS. Una aplicación exitosa de este colorante para determinar el pH en pozos de microtitulación se informa en la literatura. Los autores realizaron una medición ratiométrica. A dos longitudes de onda de excitación de 𝜆ex, 1 = 405 nm y 𝜆ex, 2 = 450 nm, la intensidad de emisión de fluorescencia se mide a 𝜆em = 520 nm, y se calcula la relación de ambas intensidades de emisión. Esta medición radiométrica reduce en gran medida los errores de medición debido al hecho de que las posibles alteraciones de la fuente de luz, los detectores ópticos y los ligeros cambios en la transmisión de luz a través de las fibras ópticas se compensan casi por completo. Además de la medición radiométrica, la referencia dual de por vida (DLF) es un método altamente preciso para realizar mediciones de fluorescencia. En ese caso, se mide el ángulo de fase de dos señales de fluorescencia estimuladas periódicamente.

Mientras que un tinte es un tinte de referencia insensible al pH, el segundo es sensible al pH. Si el pH cambia, el ángulo de fase del tinte sensible al pH también cambia, mientras que el ángulo de fase del tinte de referencia permanece constante. Finalmente, el pH puede determinarse a partir del cambio del ángulo de fase general medido. Este método es muy preciso y se minimizan los posibles errores, como las desviaciones de la señal del dispositivo de medición o la variación de la concentración de colorante, por ejemplo, el blanqueo. Kunze y col. Señaló que la medición de pH y DOT puede volverse incorrecta si las señales fluorescentes de los sensores ópticos están influenciadas por proteínas fluorescentes en el cultivo. Si los espectros de excitación de las proteínas fluorescentes en el caldo de cultivo, y los optodos de pH y DOT son similares y, además, la longitud de onda de emisión de fluorescencia de las proteínas es similar a la longitud de onda de emisión de los optodos, DOT y la señal de pH puede ser incorrecto.