Como se discutió en artículos anteriores, la acumulación de acetato en el cultivo de E. coli, el principal producto del metabolismo por desbordamiento de este organismo, está principalmente relacionada con la tasa de crecimiento específica y la tasa de absorción de sustrato (glucosa).
Las altas tasas de consumo de glucosa específica (qs) promueven la formación de acetato, independientemente de la disponibilidad de oxígeno en el cultivo.
El acetato tiene un efecto inhibidor tanto sobre el crecimiento de la biomasa como sobre la síntesis de proteínas, así como sobre la respuesta general al estrés.
Bajo la limitación de glucosa, el valor de qs está directamente relacionado con la tasa de crecimiento específica (siempre que no haya otro nutriente limitante además de la glucosa).
Por lo tanto, las estrategias de cultivo por lotes que controlan la alimentación de nutrientes son muy eficientes para prevenir el metabolismo por desbordamiento o evitar la subalimentación que causa períodos transitorios de inanición, así como para minimizar las alteraciones metabólicas causadas por la inducción de la expresión de proteínas.
Las estrategias de alimentación más simples pueden involucrar la aplicación de tasas de alimentación constantes, mayor alimentación (paso a paso) o tasas de alimentación exponenciales sin control de retroalimentación (es decir, control de circuito abierto).
Este último generalmente permite que las células crezcan a una tasa de crecimiento específica constante al alimentar con glucosa (u otra fuente de carbono) como un nutriente que limita el crecimiento.
De esta manera, la formación de acetato puede minimizarse o incluso evitarse controlando la tasa de crecimiento específica por debajo de un cierto valor umbral, que puede variar según la cepa y el medio de crecimiento, pero típicamente oscila entre 0,15 y 0,35 h − 1.
En particular, las estrategias de alimentación exponencial permiten mantener la concentración de glucosa en el caldo de cultivo en valores cercanos a cero sin fluctuaciones, minimizando así las perturbaciones en el metabolismo por desbordamiento celular.
Alternativamente, existen métodos de alimentación de nutrientes con control de retroalimentación: los métodos de pH-stat o DO (oxígeno disuelto) -stat se basan en el monitoreo en línea de los cambios en el pH o el DO, donde una alimentación de nutrientes se activa cuando el pH o el OD aumentan según la fuente de carbono que controla el crecimiento se agota.
Estos métodos de alimentación controlados por retroalimentación tienden a ser conservadores, es decir, dan como resultado una tasa de crecimiento por debajo del umbral para la producción de acetato.
Esta ventaja ha hecho que estas estrategias se utilicen ampliamente para la HCDC de E. coli.
S. cerevisiae, una levadura fermentativa (positiva para Crabtree), produce etanol a altas concentraciones de glucosa, incluso en presencia de oxígeno.
Por lo tanto, se han desarrollado estrategias similares de alimentación por lotes (es decir, limitar la alimentación de glucosa) para esta fábrica de células.
En particular, aunque la producción de proteínas en la industria se basa generalmente en cultivos de alimentación por lotes debido al riesgo de inestabilidad genética y contaminación de cultivos continuos, la insulina es producida en S. cerevisiae por Novo Nordisk en cultivo continuo.
Las levaduras Crabtree-negativas como P. pastoris ofrecen a priori la ventaja de una producción reducida de subproductos (principalmente, etanol y arabitol).
En el caso de las células de mamíferos, el cultivo por lotes está limitado por el agotamiento de nutrientes (principalmente glucosa y glutamina) y la acumulación de metabolitos tóxicos (principalmente lactato y amonio), lo que resulta en la muerte celular.
Los sistemas microbianos, se han desarrollado procesos alternativos de perfusión y alimentación discontinua para superar este inconveniente.
La alimentación controlada de glucosa y glutamina se ha utilizado ampliamente en cultivos de células de hibridoma y otras líneas celulares, utilizando sistemas de bucle de control abiertos o cerrados.
En cuanto a la formación de subproductos también se ve afectada por la composición del medio de cultivo.
Por ejemplo, se ha demostrado que la sustitución de la glucosa por otras fuentes de carbono como la manosa o la fructosa, o la combinación de glucosa con aminoácidos en el medio de alimentación reduce el acetato y aumenta el rendimiento de proteínas.
Además, se ha demostrado que el glicerol es superior a la glucosa en la reducción de la formación de acetato durante la fase de inducción de proteínas recombinantes de las HCDC de E. coli.
También se ha demostrado que el reemplazo de glucosa por glicerol en la fase discontinua del cultivo de fermentación discontinua alimentado con P. pastoris reduce la formación de subproductos (etanol y arabitol).
También se ha demostrado que el reemplazo de glucosa por glicerol en la fase discontinua del cultivo de fermentación discontinua alimentado con P. pastoris reduce la formación de subproductos (etanol y arabitol).
La sustitución de glucosa por galactosa y glutamina por glutamato produce una redistribución del flujo metabólico que conduce a tasas más lentas de formación de lactato y amonio en células de mamíferos.
Esencialmente, tanto la galactosa como el glutamato se metabolizan a una velocidad más lenta (es decir, lo que da como resultado velocidades de crecimiento celular más bajas), minimizando así la formación de subproductos.
La combinación de este enfoque con la reformulación cuidadosa de la composición de aminoácidos del medio de crecimiento en cultivos de células CHO alimentados por lotes resultó en una mayor viabilidad del cultivo, longevidad y producción de proteínas.
En general, aunque los métodos controlados por lotes alimentados proporcionan medios eficientes para prevenir el metabolismo por desbordamiento, no existe un protocolo o regla general para seleccionar la estrategia de alimentación óptima para lograr la máxima productividad de una proteína determinada.
En este contexto, los sistemas de microrreactores de alto rendimiento (p. Ej., Basados en placas de microtitulación agitadas) que proporcionan condiciones de mezcla y transferencia de gas similares a las que se encuentran en los biorreactores convencionales, además de incorporar dispositivos de monitoreo y control activo, ofrecen una poderosa herramienta para la alimentación por lotes. proceso de desarrollo.
Además, estos sistemas se pueden combinar con sistemas enzimáticos de liberación lenta de glucosa (u otro sustrato limitante), ampliando la gama de estrategias de alimentación de sustrato, por ejemplo, en E. coli y levadura.
En algunos casos, el sustrato puede ser tóxico incluso a concentraciones relativamente bajas.
Por ejemplo, el cultivo de alta densidad celular de P. pastoris utilizando los sistemas de expresión inducibles por metanol clásicos requiere un control cuidadoso del sustrato inductor.
La alta concentración de metanol en el caldo de cultivo provoca un efecto inhibidor sobre el crecimiento que afecta drásticamente la productividad del proceso.
Durante la oxidación del metanol se generan especies reactivas de oxígeno, como el peróxido de hidrógeno y otras moléculas peroxidadas, que deben eliminarse para minimizar el daño celular.
De hecho, se ha informado que la catalasa, que elimina el peróxido de hidrógeno, y una glutatión peroxidasa o peroxiredoxina, que elimina las moléculas peroxidadas, aumentan fuertemente en la fase discontinua alimentada con metanol de los cultivos de P. pastoris, concomitante con el aumento del recambio de peroxisomas.
El estrés oxidativo causado por el metanol puede aliviarse mediante la adición de antioxidantes como el ácido ascórbico.
Además, las estrategias de alimentación de metanol, en particular para las células de fenotipo Mut + (utilización de metanol), es decir, las células con la capacidad de asimilación de metanol de tipo salvaje, deben tener en cuenta los altos requisitos de consumo de oxígeno y el considerable calor generado por el metabolismo por desbordamiento del metanol a altas temperaturas. densidades celulares.
En estas condiciones, la capacidad de transferencia de oxígeno del biorreactor a menudo es incapaz de mantener la demanda metabólica de oxígeno.
Las estrategias clásicas y más simples de alimentación de metanol están asociadas con un control de oxígeno disuelto DO-stat, manteniendo un nivel mínimo alrededor del 20%.
Aunque se han desarrollado diferentes estrategias de control de DO-stat [157], el metanol no se monitoriza y la acumulación del sustrato podría ser la causa de la inhibición del crecimiento.
Aunque se han desarrollado diferentes estrategias de control de DO-stat, no se controla el metanol y la acumulación del sustrato podría ser la causa de la inhibición del crecimiento.
Alternativamente, la limitación de oxígeno se ha aplicado con éxito para controlar la absorción de metanol durante la fase de inducción (es decir, el nutriente limitante es oxígeno en lugar de metanol), lo que permite una mejora en la producción y evita la alta demanda de oxígeno dentro de los tanques de acero inoxidable.
En particular, se han aplicado estrategias de lotes alimentados con oxígeno limitado (OLFB) a la producción de anticuerpos monoclonales en cepas de P. pastoris modificadas por glicoingeniería utilizando la tasa de absorción de oxígeno como parámetro de escalamiento.
También se ha informado que OLFB reduce la lisis celular y aumenta la calidad del producto final, además de prolongar la fase de producción de la proteína objetivo.
Otra estrategia común para controlar los niveles de metanol es el control 𝜇-stat.
Se obtiene un perfil de velocidad de alimentación de metanol exponencial preprogramado a partir de ecuaciones de balance de masa en una estrategia clásica de control de bucle abierto.
En esta estrategia, el cultivo siempre se realiza en condiciones limitantes de metanol en cuanto al metabolismo por desbordamiento.
El éxito de la tasa de crecimiento específica óptima depende de la naturaleza de la proteína diana, pero es un enfoque simple muy fácil de implementar.
Se ha aplicado con éxito con diferentes proteínas en los biorreactores, obteniendo generalmente la mejor producción a bajas tasas de crecimiento específico.
Sin embargo, esta no es una regla general en el metabolismo por desbordamiento.
Por ejemplo, esta estrategia resultó en rendimientos y productividades muy bajos al producir una lipasa recombinante de Rhizopus oryzae, que se sabe que desencadena el UPR.
Todas las estrategias para el control del metanol descritas hasta ahora tienen el problema potencial de que la concentración de metanol no se mide en línea.
El metanol puede sufrir fluctuaciones a lo largo de la fase de inducción afectando negativamente la productividad del bioproceso.
Por tanto, se han desarrollado diferentes estrategias de control de circuito cerrado de metanol para evitar este problema.
En general, la productividad máxima se obtiene en el rango de 2-4 g -1 de metanol.
