La concentración de componentes del medio y metabolitos indicadores secretados por las células como azúcares, aminoácidos y subproductos (acetato, etanol, lactato, etc.) se puede cuantificar típicamente mediante métodos de HPLC, proporcionando información útil sobre el metabolismo de la célula.
Además, las tecnologías de sondeo in situ basadas, por ejemplo, en métodos basados en espectroscopía y análisis ópticos pueden proporcionar información sobre los cambios del estado fisiológico que resultan de la producción de proteínas.
Sin embargo, la interpretación o asignación de cambios de señal a parámetros relacionados con la fisiología no es sencilla.
Además, se han establecido métodos para la monitorización de metabolitos indicadores como el tetrafosfato de guanosina (ppGpp), la molécula de señal central del sistema de respuesta estricto en bacterias, y el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), una molécula señal implicada en la represión de metabolitos.
Esto ha permitido estudiar la correlación entre los niveles de expresión de genes recombinantes o el contenido de plásmidos de la célula y los niveles de concentración de estos metabolitos indicadores, arrojando información valiosa sobre la interrelación entre la producción de proteínas recombinantes y el estado fisiológico.
La cuantificación de los grupos intracelulares de ATP, ADP y AMP también es otra fuente de información sobre la impartición metabólica de la síntesis y secreción de proteínas recombinantes, ya que los grupos de adenilatos influyen directamente en estos procesos celulares que consumen energía.
Como ejemplo, la producción de proteína recombinante en E. coli usando promotores fuertes inducibles por temperatura causó una caída transitoria de la carga de energía de adenilato (AEC = [ATP + 1 / 2ADP] / [ATP + ADP + AMP]) – un indicador de la estado energético de las celdas, justo después del aumento de temperatura en los tanques de acero inoxidable.
Por el contrario, se ha informado de una disminución sostenida de AEC a lo largo de la fase de inducción de metanol de HCDC de P. pastoris cuando se usa el promotor AOX inducible por metanol en los biorreactores.
El análisis global del metabolismo de la célula huésped por medio de plataformas analíticas ómicas como transcriptómica, proteómica, metabolómica y fluxómica ahora se puede utilizar para investigar el efecto fisiológico tanto de las tensiones ambientales como de la biosíntesis recombinante, guiando la identificación de posibles dianas metabólicas para la ingeniería celular. , selección de condiciones de crecimiento y estrategias de cultivo que favorezcan la producción de proteínas recombinantes, o identificación de genes marcadores sensibles al estrés.
En particular, estas herramientas analíticas se han utilizado cada vez más para caracterizar los cambios fisiológicos globales en bacterias, principalmente en E. coli (revisado por Carneiro et al.) Y Bacillus sp., Así como en sistemas hospedadores eucariotas, incluyendo levaduras, hongos filamentosos, y células de mamíferos.
En general, el diseño de estrategias de cultivo orientadas a alcanzar rendimientos máximos de proteína recombinante suele seguir el principio de selección de modos de cultivo que permiten prolongar la fase de producción, a tasas de crecimiento controladas, así como minimizar la inducción de eventos de estrés.
Por lo tanto, es importante ajustar la tasa de producción de proteína recombinante, la capacidad del metabolismo de la célula huésped y las condiciones de cultivo, minimizando así los posibles cuellos de botella en el metabolismo.
