Monitoreo del estrés y cambios fisiológicos y la carga metabólica
El seguimiento de los cambios fisiológicos de los procesos de producción de proteínas recombinantes es la clave para la comprensión de los procesos y sistemas y, por lo tanto, la clave para el diseño y la optimización racionales de los bioprocesos en biorreactores con tanques de acero inoxidable.
La caracterización del impacto metabólico durante los procesos de producción de proteínas recombinantes a menudo se puede realizar mediante la estimación de parámetros y cambios fisiológicos clásicos, como los rendimientos de crecimiento, las tasas de crecimiento específicas máximas, así como el consumo específico de sustrato o las tasas de producción específicas de subproductos.
Estos indicadores se basan en la medición de variables como la concentración de biomasa, el consumo de oxígeno y las tasas de producción de CO2 o la concentración de sustratos y subproductos.
No obstante, estos parámetros no revelan la extensión y los aspectos mecanicistas de los cambios fisiológicos subyacentes.
Además del monitoreo estándar de variables físicas y químicas, una serie de técnicas fuera de línea y dispositivos de monitoreo de procesos en línea permiten estimar y medir parámetros y cambios fisiológicos como la viabilidad celular, producto recombinante, así como metabolitos indicadores u otros componentes celulares que responden a la adaptación fisiológica de las células a la expresión de proteínas recombinantes.
Además, la transcriptómica, la proteómica, la metabolómica y la fluxómica también se están utilizando como una herramienta para la comprensión a nivel del sistema de la respuesta celular y la adaptación a la producción de proteínas recombinantes, tanto como base de conocimientos para la mejora racional de la cepa (ingeniería metabólica) como para la identificación del estrés. genes informadores adecuados para la optimización de bioprocesos.
La producción de proteínas recombinantes lleva a las células a estados de estrés y puede conducir a la muerte celular durante el proceso de producción.
La citometría de flujo se ha utilizado ampliamente para determinar la fracción de células muertas mediante tinción diferencial de células con yodo de propidio, desde bacterias y levaduras hasta células de mamíferos.
Mediante la tinción triple con fluorocromo con yoduro de propidio, bromuro de etidio y bisoxonol, es posible discriminar entre células no dañadas, dañadas (membrana despolarizada) y muertas.
La citometría de flujo con una variedad de marcadores fluorescentes también se ha utilizado para estudiar la progresión del ciclo celular y los eventos de muerte celular programada (apoptosis) durante los cultivos de células de mamíferos en biorreactores, que ha demostrado ser una herramienta valiosa para la optimización de estrategias de cultivo y tecnologías analíticas de procesos.
Esta técnica también se puede aplicar para medir una amplia variedad de rasgos metabólicos complejos, por ejemplo, la detección de la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y condiciones redox in vivo.
El plegamiento y la secreción de proteínas oxidativas pueden sobrecargar la capacidad redox del retículo endoplásmico (RE), lo que resulta en la acumulación de ROS y proteínas mal plegadas / desplegadas en este compartimento.
La tinción de ROS se puede lograr típicamente usando diferentes sondas fluorescentes como DHE (dihidroetidio), DHR (dihidrorrodamina 123) y DCF (2 ′, 7′-diclorodidrofluoresceína), mientras que un estudio reciente ha demostrado que las condiciones redox in vivo en el RE y el citosol de las células de levadura puede controlarse dirigiendo variantes de GFP sensibles a redox (roGFP) a los respectivos orgánulos.
El último procedimiento es un ejemplo de un biosensor codificado genéticamente, que no requiere la adición de sustancias químicas exógenas.
Dichos biosensores también pueden diseñarse de tal manera que la expresión de la proteína fluorescente esté bajo el control transcripcional de un promotor cuya actividad está regulada por la señal intracelular de interés, por ejemplo, promotores sensibles al estrés.
Por ejemplo, la señal de fluorescencia de GFP expresada en E. coli bajo un promotor sensible al estrés se puede medir mediante espectroscopia de fluorescencia de longitud de onda múltiple 2D o citometría de flujo, lo que permite el monitoreo de estrés in vivo en línea o en línea, como una alternativa a la medición directa. de los niveles de ARNm de genes de estrés seleccionados.
Los componentes proteicos de superficie e intracelulares (incluidos los cuerpos de inclusión) también se pueden teñir mediante técnicas de inmunofluorescencia para el análisis de citometría de flujo posterior. Para acceder a los objetivos intracelulares, las células se permeabilizan suavemente.
Se han utilizado procedimientos de inmunotinción intracelular para monitorizar y cuantificar la formación de cuerpos de inclusión en E. coli o el producto recombinante retenido en las células y los marcadores UPR como la proteína BiP en levadura.
BiP es un acompañante de la clase HSP70 que juega un papel importante en la respuesta al estrés de las proteínas desplegadas.
De lo contrario, las proteínas de fusión GFP y GFP se pueden usar para correlacionar la fisiología de una sola célula y la población con los niveles de expresión de proteínas recombinantes, lo que proporciona una herramienta valiosa para optimizar las estrategias de cultivo / inducción.
Cabe destacar que la citometría de flujo es compatible con la implementación de análisis multiparamétricos (multiplexados), mejorando la discriminación de estados y cambios fisiológicos, además de proporcionar información valiosa sobre la heterogeneidad fenotípica de una población microbiana.
Además, estos procedimientos pueden automatizarse potencialmente conectando un citómetro de flujo directamente a un biorreactor, ofreciendo una herramienta muy poderosa para monitorear las propiedades fisiológicas de las células microbianas y de mamíferos en condiciones relacionadas con el proceso.