Usando un reportero rpoS:GFP, intentaron monitorear el nivel de la respuesta general al hambre basada en聽饾湈S. Curiosamente, observaron una menor acumulaci贸n de niveles de GFP en biorreactores y (ii) un mayor grado de diferenciaci贸n del nivel de expresi贸n de GFP en la poblaci贸n celular de los cultivos heterog茅neos. Se obtuvo m谩s informaci贸n con reporteros de niveles de GFP en biorreactores inestables (mutantes gfpAAV), que se clonaron detr谩s de diferentes promotores.
En todos los casos (promotores probados: rrnB, fis, rpoS), los niveles de GFP en biorreactores fueron m谩s bajos en cultivos c铆clicamente perturbados en comparaci贸n con los cultivos con alimentaci贸n continua, aunque todav铆a es una pregunta abierta si la disminuci贸n de los niveles GFP en biorreactores se debe a la disminuci贸n de la actividad del promotor distinto o debido a una mayor actividad proteol铆tica en condiciones perturbadas.
驴Las condiciones no homog茅neas conducen a una mayor heterogeneidad de la poblaci贸n? Esta interesante cuesti贸n, que est谩 muy relacionada con la robustez de los procesos, se estudia actualmente desde diferentes vertientes. Delvigne et al. encontraron, en experimentos con perturbaciones c铆clicas, dos poblaciones de c茅lulas de E. coli sobre la base de la fluorescencia del reportero de niveles de GFP en biorreactores. Cuando se recolectan y se vuelven a cultivar, estas dos poblaciones se convierten en una sola poblaci贸n, lo que indica que existe una heterogeneidad transitoria. La raz贸n podr铆a ser una heterogeneidad fenot铆pica, que aumenta en condiciones ambientales perturbadoras.
Han estudiado algunos investigadores el efecto del CO2 en un simulador de reducci贸n de escala STR-STR de dos compartimentos para concentraciones de hasta 300 mbar mientras variaba los tiempos medios de circulaci贸n entre 50 y 375 s.
Como resultado, encontraron una reducci贸n de la tasa de crecimiento espec铆fica, una mayor formaci贸n de acetato y una reducci贸n de los niveles de GFP en biorreactores del producto recombinante en un tercio. La expresi贸n g茅nica solo se vio afectada por la concentraci贸n m谩s alta de CO2.
Los ARNm de glutamato descarboxilasa (gadA) y antiportadores de glutamato/谩cido 饾浘-aminobut铆rico (gadC) estaban elevados, y dos componentes del complejo 饾浖-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA, sucB) estaban regulados a la baja.
Esto puede indicar una inhibici贸n de la actividad del ciclo del 谩cido tricarb贸nico, de forma similar a la observada anteriormente en E. coli.
Una pregunta interesante es si las perturbaciones pueden tener un efecto positivo en un proceso a gran escala. Otros investigadores descubrieron recientemente que una prote铆na heter贸loga (fosfatasa alcalina), que se expresa como un producto peripl谩smico en E. coli, se produce a niveles m谩s altos con un perfil de alimentaci贸n c铆clica.
Curiosamente, en otro estudio, los autores descubrieron que se libera m谩s producto en el medio de cultivo (aumento del 60 %) en cultivos con perturbaciones c铆clicas en comparaci贸n con condiciones bien mezcladas y homog茅neas.
Como procedimiento 贸ptimo final, los autores proponen un perfil de alimentaci贸n triangular, que se aplica despu茅s de la inducci贸n. Estos resultados son hasta ahora una excepci贸n.
En la mayor铆a de los casos, el rendimiento de un producto recombinante disminuye significativamente por la exposici贸n del cultivo a condiciones no homog茅neas.
Esto se ha observado para una variante inestable de la prote铆na A, donde el menor rendimiento se relacion贸 con una mayor actividad proteol铆tica.
La alimentaci贸n c铆clica de glucosa en condiciones completamente aer贸bicas result贸 en una alta inestabilidad proteol铆tica de la 饾浖-glucosidasa de levadura expresada heter贸logamente en E. coli.
El ciclo entre condiciones aer贸bicas y anaer贸bicas conduce a una disminuci贸n significativa del rendimiento de insulina recombinante, como lo demuestra un estudio con diferentes tiempos de circulaci贸n en un sistema STR-STR de dos compartimentos.
Uno de los microorganismos industriales m谩s importantes es C. glutamicum.
Sorprendentemente, las primeras investigaciones sobre la robustez de C. glutamicum en condiciones a gran escala consideran el desarrollo de un biorreactor especial de escala reducida con un tiempo de mezcla m谩s prolongado (螛90 = 130 s frente a 10 s), que se seleccion贸 teniendo en cuenta la entrada de potencia espec铆fica (P/V) de un reactor de producci贸n de 10 m3.
Este aumento del tiempo de mezclado se logr贸 implementando cinco discos fijos entre seis turbinas Rushton.
Como resultado, los cultivos en este reactor de escala reducida mostraron un crecimiento reducido (-7 %) relacionado con un menor consumo de az煤car y amon铆aco y una menor producci贸n de lisina (-12 %). Sin embargo, C. glutamicum parece ser relativamente robusta.
Ni el estr茅s mec谩nico extremo ni la alta aireaci贸n o las bajas concentraciones de ox铆geno disuelto causaron una respuesta fisiol贸gica significativa.
Esta elevada robustez de C. glutamicum, que podr铆a ser una de las razones de su extraordinario 茅xito industrial, tambi茅n fue confirmada por los estudios realizados por K盲脽 et al.
Estudiaron el impacto de la zona de alimentaci贸n (acceso de glucosa concomitante y limitaci贸n de ox铆geno) en un sistema de reactor de dos compartimentos que consiste en un STR aireado acoplado a un m贸dulo PFR no aireado.
Los autores aplicaron diferentes cepas, una cepa de tipo salvaje y una superproductora de lisina, y diferentes tiempos de residencia en el m贸dulo PFR de hasta 3 min.
Curiosamente, solo se encontraron diferencias en la acumulaci贸n de lactato, pero no hubo reducci贸n del rendimiento del crecimiento ni p茅rdidas de productividad.
Recientemente, se realizaron cultivos en reactores de dos y tres compartimentos con C. glutamicum y se compararon con un cultivo STR est谩ndar.
Mientras que el STR estaba aireado, los dos PFR acoplados no estaban aireados: uno con adici贸n de alimento y el segundo sin 茅l.
Los resultados mostraron que el lactato y el succinato, as铆 como una serie de amino谩cidos (glicina, treonina, glutamato, glutamina), que se derivan del metabolismo central del carbono, se acumularon hasta el doble en el cultivo del reactor de tres compartimentos que en el de dos. cultivo en reactor compartimental.
En contraste con el cultivo en reactor de dos compartimentos, no se observa acumulaci贸n intracelular de piruvato en el cultivo en reactor de tres compartimentos, ya que los flujos de carbono se dirigen hacia el lactato.
Esta adaptaci贸n de las c茅lulas, que puede considerarse exitosa, se revela mediante un an谩lisis de citometr铆a de flujo de c茅lulas te帽idas con BOX y una serie de mediciones electro贸pticas en l铆nea de la polarizabilidad celular.
Ambos m茅todos indican una mayor polarizabilidad de las c茅lulas en el cultivo del reactor de tres compartimentos.
La tinci贸n con PI no indica ning煤n da帽o significativo en la membrana ni muerte celular acelerada en ninguno de los sistemas.
Sin embargo, aunque la cepa muestra robustez, el rendimiento del producto de lisina se redujo en cultivos reducidos, lo que subraya la importancia de la optimizaci贸n del proceso.
Recientemente, Buchholz investig贸 el efecto de los niveles oscilantes de CO2/HCO3 en un biorreactor en cascada de tres compartimentos sobre el rendimiento de biomasa, as铆 como el metaboloma y la respuesta transcripcional de una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum y un productor de lisina.
El tiempo de residencia en el ambiente elevado de CO2/HCO3 se ajust贸 a 3,6 min a una relaci贸n de volumen de 8,4%, lo que pareci贸 ser relevante para la escala de producci贸n industrial.
Se aplicaron gradientes de presi贸n de pCO2 de 75-315 mbar.
Aunque m谩s de 60 genes se regularon hacia arriba o hacia abajo en estas condiciones seg煤n el gradiente de presi贸n y el tiempo de residencia, no se encontraron cambios notables en la concentraci贸n de biomasa y producto en comparaci贸n con el cultivo de referencia.
Estos hallazgos interesantes indican no solo una fuerte respuesta a la disponibilidad oscilante de CO2, sino tambi茅n una alta robustez de C. glutamicum, aunque quedan por resolver los mecanismos detallados.