Procesos integrados en biorreactores.
En un ejemplo extremo pero impresionante de procesos integrados en biorreactores es el de Caparon y su equipo, ellos informaron sobre los desafíos de purificación que Pfizer enfrentó al purificar una variante de apolipoproteína producida en E. coli.
Parecía que varios HCP (proteínas de alto contenido en histidina) se estaban coeluyendo con el producto, y que se estaba generando una forma truncada del mismo.
Los procesos integrados en biorreactores de purificación que involucraron cinco pasos cromatográficos (tres de intercambio iónico y dos de hidrofobicidad) fue insuficiente para proporcionar una eliminación sólida de los HCP.
Se utilizaron múltiples métodos analíticos, incluyendo electroforesis en gel 1D y 2D, Western blot, deglicosilación de proteínas, espectrometría de masas (MS), degradación de Edman y un ELISA sandwich.
El análisis de Western blot bidimensional de las muestras purificadas de ApoA-1M detectó dos HCP principales junto con 6-7 especies menores de HCP. Estos dos HCP principales tienen pesos moleculares alrededor de 60 kDa, cada uno exhibiendo múltiples formas en el gel 2D de una muestra de proteína purificada en procesos integrados en biorreactores.
Tanto el peso molecular como el punto isoeléctrico de estos HCP son bastante cercanos a los del dímero del producto (56 kDa, pI: 5.1-5.3), lo que puede explicar por qué se copurificaron con el producto.
Esto permitió localizar estos HCP en el gel teñido correspondiente con una alta carga y luego aislarlos mediante electroforesis 2D para su identificación mediante espectrometría de masas.
Se identificaron tres HCP: una proteína de unión a dipéptidos y una proteína de unión a oligopéptidos con tamaños y cargas cercanas a las del dímero del producto, ambas presentes en abundancia en el periplasma de E. coli; una proteína periplásmica de unión a maltosa con un tamaño ligeramente más pequeño.
Además, se sospechó que una proteasa bacteriana fue la causa de la reacción de clivaje del producto en los procesos integrados en biorreactores. Se decidió llevar a cabo un proceso de segunda generación eliminando secuencialmente los genes de estos cuatro compuestos, utilizando un método descrito por Link et al.
Los resultados muestran que la eliminación 2 se refiere a la eliminación de las proteínas de unión a dipéptidos y oligopéptidos, la eliminación 3 se refiere a la eliminación adicional de la proteína de unión a maltosa, y la eliminación 4 se refiere a la eliminación adicional de la proteasa.
Se puede observar en la tabla que estas identificaciones fueron exitosas: el nivel de HCP se ha reducido drásticamente (los Western blots 2D correspondientes – datos no mostrados – no presentan ninguna traza de los HCP vistos anteriormente).
Además, el porcentaje de la forma de producto truncado está bien controlado, lo que indica que la proteasa fue la causa de la truncación.
El proceso de purificación en biorreactores para este proceso de próxima generación se simplificó drásticamente, con solo dos columnas de pulido necesarias para lograr la pureza deseada.
Este es un ejemplo inusual, tanto en el nivel de dificultad del proceso de purificación como en el grado de éxito que las eliminaciones genéticas pudieron proporcionar. Sin embargo, muestra el valor de hacer cambios fundamentales cuando el problema es lo suficientemente difícil en procesos integrados en biorreactores.
Otra tendencia importante en el procesamiento integrado es el uso de operaciones unitarias continuas. Si bien la ingeniería clásica sugiere que los procesos operados continuamente en estado estacionario son más eficientes que los procesos por lotes, la industria biotecnológica ha estado históricamente dominada por el procesamiento por lotes.
Aunque algunos productos fueron fabricados comercialmente mediante cultivo celular de perfusión, fueron excepciones; y hasta ahora no se ha fabricado ningún producto biológico comercial utilizando cromatografía continua.
Sin embargo, tanto el cultivo de perfusión como la cromatografía continua están siendo evaluados críticamente por muchas empresas en colaboración con muchos académicos, y el futuro cercano puede decidir si se avecina un cambio drástico en el procesamiento biológico.
Genzyme ha realizado una contribución sustancial para demostrar la robustez de dichos procesos continuos para biológicos complejos: sus publicaciones recientes han demostrado que la estabilidad del proceso y la calidad del producto se han mantenido durante muchas semanas en una sola ejecución de un proceso continuo.
Su documento reciente resumió sus hallazgos. Utilizaron biorreactores de perfusión y cromatografía periódica contracorriente de cuatro columnas (PCC) para producir y purificar varios terapéuticos ejemplares, incluyendo un mAb y una enzima humana recombinante.
Se logró un estado cuasiestacionario en el biorreactor en aproximadamente 50-60 millones de células ml−1 durante más de 60 días.
El sistema PCC completamente automatizado se ejecutó durante más de 30 días, con una calidad de producto comparable a la de un proceso de purificación por lotes tradicional.
Esta integración se logró con la eliminación de varios pasos de retención que serían necesarios en la operación de lotes tradicional.
La literatura se beneficiaría de otros informes de este tipo que describan procesos continuos operados durante largos períodos.