Expresión de alto nivel de proteínas recombinantes
Se ha reconocido y documentado desde hace mucho tiempo que la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes heterólogas tiene un impacto directo en el metabolismo del huésped, a menudo afectando negativamente los parámetros de crecimiento como la tasa de crecimiento, el rendimiento de biomasa y la tasa de consumo de sustrato específico, por ejemplo, en bacterias, levaduras, y células de mamíferos.
Estos obstáculos son responsables de limitar la cantidad de proteína extraña que se puede producir a partir del organismo.
Por un lado, la expresión de genes extraños conduce a un aumento en la transcripción y traducción específicas, que puede llegar a ser limitante a niveles muy altos debido al agotamiento de precursores y energía, como se describe para E. coli.
Además, se ha descrito una carga metabólica relacionada con el mantenimiento del plásmido.
Además, E. coli provoca una respuesta al estrés como resultado de la sobreexpresión de proteínas recombinantes que desencadena la regulación positiva de los genes del estrés, incluidos los genes de choque térmico, chaperona y que codifican proteasas.
En este caso, se ha demostrado que la formación de agregados de productos (cuerpos de inclusión) y productos mal plegados, como resultado de altas tasas de síntesis, es un factor importante.
No obstante, el perfil transcripcional de las respuestas al estrés a la expresión de alto nivel de proteínas en cultivos de alta densidad celular es diferente al de los cultivos de baja densidad celular.
También se ha informado de la carga asociada con la demanda metabólica de síntesis de proteínas recombinantes para la expresión de alto nivel de productos intracelulares en levaduras.
Sin embargo, considerando las productividades específicas moderadas de las proteínas secretadas que a menudo se logran en los sistemas de levadura, las limitaciones en la síntesis, transcripción y traducción de aminoácidos no parecen ser un obstáculo importante.
Aún así, la demanda de energía es significativamente mayor para las proteínas secretadas, ya que el plegamiento, la glicosilación y la secreción son vías que consumen mucha energía.
De hecho, se ha observado una carga metabólica relacionada con la secreción de proteínas en levaduras, incluso a niveles de expresión bajos a medios.
Existe una amplia evidencia de limitaciones en la translocación de la membrana, el procesamiento de la secuencia de señales y el plegamiento dentro del retículo endoplasmático.
Se han descrito respuestas de estrés celular a proteínas desplegadas (respuesta de proteína desplegada, UPR) para levaduras, hongos filamentosos y eucariotas superiores, y se ha demostrado que se desencadenan tras la sobreexpresión de una proteína recombinante secretada, lo que aumenta el metabolismo demanda de los procesos de plegamiento y secreción.
La UPR también está relacionada con la degradación de proteínas a través de la vía de degradación de proteínas asociada a ER (ERAD), un proceso que detecta proteínas mal plegadas y las redirige a la degradación proteasomal en el citosol, actuando como una vía de alivio del estrés.
En este contexto, las mediciones recientes de los flujos intracelulares de proteínas secretadas en levadura utilizando estrategias de marcaje isotópico han revelado que una fracción significativa de la proteína recombinante sintetizada (más del 50%) está realmente degradada.
Además, la UPR regula varios procesos metabólicos como la síntesis de lípidos y aminoácidos, además de regular negativamente la expresión de proteínas secretadas en hongos.
En general, los procesos de plegado, modificación postraduccional y transporte son costosos en términos de energía y bloques de construcción de carbono.
Es importante destacar que la interacción de las tensiones externas (p. Ej., Temperatura, pH, osmolaridad, disponibilidad de oxígeno) y la tensión intrínseca desencadenada por la sobreexpresión de proteínas, en particular por el plegamiento y la secreción, juega un papel importante en las limitaciones fisiológicas de un sistema de producción, que comparten patrones similares entre diferentes clases de fábricas de células.
Limitaciones fisiológicas en cultivos a gran escala
Además, un problema importante en los cultivos microbianos y celulares recombinantes a gran escala es la existencia de condiciones ambientales heterogéneas generadas por biorreactores industriales a gran escala, por ejemplo, temperatura, pH, tensión de oxígeno disuelto o fluctuaciones de concentración de sustrato.
Tales condiciones hidrodinámicas no ideales en biorreactores a gran escala se han estudiado en biorreactores reducidos, que consisten en una parte mixta conectada a una parte no mezclada por una bomba de recirculación, imitando así las condiciones hidrodinámicas encontradas a gran escala.
Se ha demostrado que las condiciones heterogéneas, como los gradientes de sustrato en cultivos en biorreactores a gran escala de E. coli recombinante, reducen el rendimiento celular y aumentan la formación de subproductos, así como la lisis celular, lo que da como resultado la proteólisis del producto.
La concentración de sustrato oscilante y los niveles de oxígeno disuelto condujeron a una disminución de la absorción de glucosa en biorreactores, la formación de etanol y una síntesis de aminoácidos alterada en Bacillus subtilis, mientras que las condiciones limitantes de oxígeno oscilante disminuyeron la tasa de crecimiento específico y aumentaron la formación de subproductos en Pichia pastoris.
Además, las inhomogeneidades en los biorreactores a escala de producción también pueden afectar la calidad del producto en cultivos de células de mamíferos, donde se ha informado que las condiciones heterogéneas en el oxígeno disuelto afectan la N-glicosilación de varias proteínas recombinantes en cultivos de células de mamíferos.