Biorreactores – Uso de un BRoC como quimiostato de una sola célula
Los quimiostatos también se han utilizado para medir la dinámica en bacterias individuales, observando el crecimiento celular y la expresión de GFP mientras se mantiene una población bacteriana de la misma edad. La principal ventaja del aislamiento celular es la capacidad de estudiar células individuales en ausencia de comunicación. Sin embargo, existe la necesidad de tener un suministro continuo de nutrientes a las células aisladas y se debe eliminar el exceso de células del sistema para mantener una densidad de población en estado estacionario. Las células se cultivaron en surcos de tal manera que las células parentales se eliminan del canal en ambos extremos por los medios que fluyen. Estos quimiostatos unicelulares pueden fabricarse en agarosa fundida contra un molde intermedio de PDMS (litografía suave) con surcos submicrométricos. La agarosa tiene numerosos beneficios: menos estrés mecánico en las células, un entorno de nutrientes más uniforme y un mejor intercambio de pequeñas moléculas entre las células, en comparación con un sustrato PDMS. Se podría usar un sistema como el quimiostato de células individuales para optimizar el cultivo bacteriano seleccionando aquellas células con las mejores propiedades para la tarea en cuestión. Otros sistemas unicelulares incluyen microcavidades que permiten una célula por cavidad, sin embargo, las barreras físicas pueden afectar el comportamiento celular y pinzas ópticas que permiten estudiar, por ejemplo, el movimiento quimiotáctico de una sola E. coli. Sin embargo, un rayo láser enfocado plantea algunas preocupaciones sobre el calentamiento local y el fotodaño por irradiación a la estructura celular. El análisis de crecimiento ha demostrado que el tiempo de duplicación en los sistemas unicelulares es de alrededor de 42 minutos, mientras que en general esto es de aproximadamente 60 minutos para E. coli, ya que las células individuales no se ven afectadas por la señalización a nivel de la población o la acumulación de células.
Células de mamíferos en el biorreactor de chip
Los dispositivos microfluídicos se prestan bien para cultivos de células de mamíferos. El aumento de los dispositivos microfluídicos con cultivos de células de mamíferos servirá como un vínculo invaluable entre los modelos in vitro e in vivo, y así reducirá el número de estudios en animales y los costos para desarrollar nuevos medicamentos.
Solo uno de cada diez medicamentos que ingresan a los ensayos clínicos alcanza la etapa de aprobación. La razón principal de este fracaso es la imprevista falta de eficacia y toxicidad. Como tal, existe la necesidad de mejorar los ensayos in vitro para predecir la eficacia y la toxicidad de los fármacos candidatos. El «estándar de oro» todavía es evaluar la toxicidad y la eficacia del fármaco basado en células en placas de micropocillos. Sin embargo, la previsibilidad de tales ensayos no es satisfactoria ya que no representan el cuerpo humano en ningún aspecto; solo se cultiva un solo tipo de célula a la vez, sin considerar la típica interacción célula-célula encontrada en los tejidos. En las placas, las células tienen una configuración 2D, mientras que en los tejidos, las células están rodeadas por un ECM y otras células de soporte. Además, el microambiente que rodea los cultivos celulares 2D en placa carece de transporte de nutrientes, estrés por cizallamiento, señalización química y mecánica que se encuentra en los tejidos. Esta morfología 2D no refleja el estado in vivo de las células en 3D, ya que tiene una expresión diferente en 142 genes, alterando la función y respuesta de la célula. Esto significa que los cultivos de células 2D se comportarán intrínsecamente de manera diferente a los cultivos de células 3D, lo que también explicaría el hecho del fracaso del fármaco en ensayos clínicos en humanos. Por lo tanto, los cultivos de células 3D ofrecen un entorno más in vivo en comparación con el 2D, tanto para células de mamíferos como microbianas. La tecnología microfluídica permite la implementación de un cultivo tridimensional (3D), que puede imitar el estado in vivo de las células. Otro método para crear un entorno 3D es encapsular las células en hidrogeles.
Un aspecto de los cultivos de células 3D, que no debe pasarse por alto, es el transporte limitado de nutrientes dentro y fuera del cultivo. Después de unos días (3 días) de cultivo, el cultivo celular 3D es una estructura densa de células y ECM. El transporte difusivo es predominante dentro de la matriz celular 3D, donde a menudo los nutrientes y el oxígeno no pueden llegar al centro del cultivo. Esto causa necrosis celular en el centro del cultivo celular 3D. Para superar este problema, una solución es limitar el tamaño del cultivo celular 3D. Una cultura con una distancia de 100 μm desde el borde de la cultura hasta el centro puede mantenerse. El concepto central aquí es mantener un estado similar al tejido mediante el uso de transporte de masa microfluídica que imita la microvasculatura del tejido. Aquí es donde la microfabricación puede ayudar. La característica clave es tener una cámara celular estrecha (<200 μm de ancho), que está expuesta al medio a través de paredes porosas. Se ha fabricado una serie de micropilares, flanqueados por un canal de alimentación media en ambos lados. Otro método fue fabricar una barrera microfluídica microporosa que formara una bolsa de tamiz para recoger las células durante la siembra. Se mantuvo un flujo medio alrededor del bolsillo de la celda. Estos dispositivos de cultivo celular 3D son cultivos celulares de alta densidad (> 2000 células mm − 2), a diferencia de las suspensiones celulares. El uso de trampas microfluídicas también puede controlar los cultivos 3D. Una trampa facilita la captura de células y, como tal, la agregación al tiempo que ofrece un intercambio eficiente de nutrientes y gases. El tamaño de la trampa determina el tamaño del esferoide formado. Otras formas de controlar el tamaño del esferoide incluyen una agregación forzada centrífuga o el uso de plantillas adhesivas microfabricadas.
El mantenimiento o incluso el aumento de las funciones celulares se obtiene mediante cultivos celulares en 3D y los factores solubles apropiados. Otro enfoque para aumentar las funciones celulares es por cocultivos. Por ejemplo, cuando los hepatocitos primarios se cultivan conjuntamente con células no parenquimatosas, hay un aumento significativo en las funciones de los hepatocitos en comparación con un monocultivo de hepatocitos. Además, en cocultivos, un cultivo perfundido tiene tasas de producción metabólica significativamente más altas en comparación con los cocultivos estáticos. En el caso de un cocultivo de hepatocitos humanos y células no parenquimatosas, los hepatocitos expresaron canalículos biliares después del cuarto día de cultivo.
La integración de las técnicas convencionales de cultivo celular con la tecnología de microfabricación dio como resultado «células en un chip». Con la microfabricación, es posible reproducir sistemas multiorgánicos con circulación sanguínea, el llamado «cuerpo en un chip». Teniendo en cuenta los cultivos de células 3D, tales sistemas pueden imitar sistemas in vivo de manera más realista. Como tal, ha habido un aumento en los sistemas microfluídicos de cultivo celular en 3D y el cribado de toxicidad de fármacos, especialmente con hepatocitos. Mediante el uso de generadores de gradiente, es posible obtener un valor para el IC50 en una ejecución del sistema. Además, el uso de matrices de 20 × 50 con células encapsuladas en hidrogel podría producir resultados de ensayos de toxicidad de manera de alto rendimiento con valores de CI50 comparables a la tecnología convencional de 96 pocillos.
Humedad y estabilidad ambiental en fermentadores
Los BRoC fabricados en PDMS pueden tener algún problema con la evaporación de los medios al operar el dispositivo como un cultivo estático. Para evitar la evaporación, el dispositivo debe colocarse en un ambiente de alta humedad. Una opción es colocar el dispositivo (y todas las bombas, equipos de control y detección necesarios en una incubadora junto con algunos platos de agua). Una incubadora también puede controlar la composición del gas y la temperatura necesaria. Otra forma, mucho más fácil, es encerrar el dispositivo en una pequeña caja hermética de aluminio con ventanas en la parte superior e inferior para la interrogación óptica. Nuevamente, colocar los platos con agua asegurará una alta humedad. Como el volumen interior de la caja es grande en comparación con la cámara del biorreactor, pueden fluir gases para controlar la composición del gas por encima del cultivo celular. Además, la caja de aluminio proporciona una gran masa térmica para mantener la temperatura estable en el punto de ajuste deseado. La temperatura puede controlarse mediante el uso de un baño de agua, para que el agua fluya a través de la base de la caja.
Oxigenación
Los medios deben contener suficiente oxígeno para mantener un cultivo celular en microfluídica. Hay algunas formas de lograr esto. Una forma de no ejecutar esto es burbujeando oxígeno a través de los medios antes de inyectarlo o de enviarlo al microbioreactor. Esto provocará burbujas dentro de los BRoC, que bloquearán el canal y provocarán la muerte celular. Los BRoC fabricados en PDMS tienen algunas ventajas con respecto a la transferencia de gas. PDMS tiene una alta permeabilidad a gases, incluidos oxígeno y dióxido de carbono. Por lo tanto, el oxígeno puede transferir fácilmente una membrana de aireación con un espesor de 100 μm entre el biorreactor y la cámara de gas. En este caso, la membrana se colocó directamente encima de la cámara de cultivo celular. Otra forma de aireación es a través del ajuste de silicio permeable a los gases.
Organismos modelo aplicados a BRoC
Se utilizan varias células microbianas en biorreactores, pero no todas han llegado a BRoC todavía. Los modelos típicos incluyen procesos de fermentación con E. coli (bacterias gramnegativas) y Saccharomyces cerevisiae (levadura), que se utilizan para la producción de proteínas y estudios genómicos, y Cyclotella cryptica (algas) como fuente potencial de biocombustible. Otros modelos se basan en células de mamíferos, siendo el más importante el modelo de hígado. Sin embargo, otros órganos se están incluyendo rápidamente en un área llamada «órgano-en-un-chip». Recientemente, ha habido otro desarrollo utilizando cultivos de hESC en condiciones estables y dinámicas. Un caso especial es la plaqueta BRoC. El objetivo principal aquí es reproducir el microambiente de la médula ósea para permitir que los megacariocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos produzcan plaquetas. Estas plaquetas deberían generar cantidades clínicamente suficientes de plaquetas humanas funcionales para compensar los riesgos asociados con la adquisición y el almacenamiento de plaquetas donadas.
Pero en los últimos años, lo que constituye un biorreactor ha sido borroso. En general, los biorreactores se pueden considerar como dispositivos que implican un flujo diseñado o programado, donde el flujo se utiliza para mejorar el transporte molecular, proporcionar estimulación mecánica, controlar la adición de fármacos y reguladores biológicos, o influir en cultivos celulares que de otro modo no serían posibles en cultivos estáticos.
Aplicaciones del chip de biorreactor microfluídico
El proceso de fermentación se puede ejecutar en diferentes modos, como los modos por lotes, los lotes alimentados y los cultivos continuos. Otras aplicaciones incluyen células de mamíferos en dispositivos microfluídicos. La motivación en la mayoría de las aplicaciones es investigar la respuesta del cultivo celular para el desarrollo del proceso o capturar los efectos fisiológicos y fisiopatológicos in vitro para satisfacer las necesidades terapéuticas.
Un quimiostato BroC
Un quimiostato, o biorreactor continuo, es un biorreactor que se suministra con medio fresco continuo, mientras que el líquido de cultivo se elimina constantemente, manteniendo constante el volumen de líquido en el biorreactor, al tiempo que incluye la mezcla de medios y las mediciones en línea de OD, pH y OD. Además, la biomasa celular y las concentraciones del producto se mantienen constantes. Al cambiar la velocidad de flujo del medio en el reactor, se puede controlar la velocidad de crecimiento del microorganismo. En un macrobiorreactor, tanto la entrada como la salida deben controlarse por igual. Sin embargo, en un sistema microfluídico, un quimiostato sería un sistema de perfusión en el que las concentraciones de biomasa y producto permanecen constantes. Debido al comportamiento laminar del flujo, todo lo que fluye entra automáticamente del microbioreactor, ya que no es posible un flujo turbulento. Esto también implica que el volumen del microbioreactor es constante. La única variable, aparte de la composición del medio, será la velocidad de flujo del medio, que a su vez determinaría la cantidad de nutrientes dirigida al reactor.
Sensores integrados para parámetros clave de biorreactores
La detección y el control son cruciales para obtener resultados significativos en biorreactores. Por ejemplo, el crecimiento y la productividad de los microorganismos dependen del pH y la temperatura, mientras que otros factores como el oxígeno disuelto y la concentración de CO2 también juegan un papel importante, al menos en los biorreactores estándar.
El control y la medición a menor escala se vuelven extremadamente difíciles debido a la baja concentración y volúmenes de productos, ya sean productos metabólicos o enzimáticos. Una HPLC típica requiere una muestra de 50 μl, pero el volumen de un BRoC puede ser de 100 nl. Por lo tanto, un requisito esencial para los biorreactores basados en microfluidos son los sensores en línea para medir los parámetros de reacción. La ventaja de la microtecnología es que permite integrar sensores en el chip. Varias técnicas de sensores para medir los diferentes parámetros incluyen sensores electroquímicos, sensores de fluorescencia, sensores de quórum y sensores de bioluminiscencia. El problema con los microbioreactores y los sensores ópticos es el tamaño. Es posible que se deban utilizar filtros para separar las longitudes de onda de excitación y emisión de las diferentes longitudes de onda necesarias para excitar los diferentes optodos o sensores ópticos. Las fibras ópticas se pueden utilizar para guiar la luz en espacios pequeños.
Temperatura
Debido al tamaño del BRoC, mantener una temperatura constante no es tan difícil si hay un disipador de calor lo suficientemente grande, en comparación con los sistemas convencionales, lo que puede llevar mucho tiempo elevar la temperatura. Se necesitan casi 10 minutos para elevar la temperatura en un recipiente de 16 l, pero solo unos minutos en un microbiorreactor para elevar la temperatura en 10 ° C. Una placa calefactora estable, un baño de agua, un calentador de aluminio, un calentador de encendido y apagado, un calentador Peltier con controlador PID o colocar el dispositivo en una incubadora son algunas formas para mantener una temperatura estable. Además, los calentadores se pueden integrar en chip utilizando calentadores microfabricados. Cabe señalar que, debido a su tamaño de calor, la transferencia es grande y muy rápida. Por lo tanto, el sistema debe colocarse en un área sin convección, como un gabinete cerrado de bioseguridad.
La forma más común de medir la temperatura en un chip es usar termistores integrados o detectores de temperatura de resistencia (RTD). En RTD, la resistencia del sensor varía según la temperatura. Por lo general, están hechos de platino (por ejemplo, sensores Pt100 o Pt1000), pero también pueden estar hechos de oro. La medición y el control de la temperatura se realizan fuera del chip y pueden controlarse por computadora.
Los sensores de pH estándar no se pueden usar en chip, debido a su tamaño. Otros métodos que permiten mediciones de pH en chip incluyen sensores ópticos en puntos de fluorescencia (optodos) o iones metálicos sensibles al pH, y transistores de efecto de campo sensibles a iones de estado sólido (ISFET). Sin embargo, se prefieren los sensores ópticos debido a su naturaleza no invasiva, facilidad de integración y precio, que se prestan bien para BRoC desechables. Los sensores ópticos de pH se excitan con un LED azul de onda cuadrada modulada (465 nm) y se miden con un amplificador de bloqueo para determinar el cambio de fase, que se correlaciona con el pH. El último desarrollo es en nanosensores basados en nitruros de aluminio y galio (AlGaN / GaN). En comparación con un ISFET, exhibe una estabilidad química superior y biocompatibilidad, mientras que tiene una transparencia favorable en el espectro visible.
O2
La concentración de oxígeno disuelto también se puede medir ópticamente utilizando optodos, que se basan en la extinción de la fluorescencia por oxígeno. La sensibilidad óptima de estos optodos es a bajas concentraciones de oxígeno, lo cual es relevante para una variedad de procesos de biorreactor. Los puntos sensores también pueden fabricarse incrustando octaetilporfirina-cetona de platino (II) (PtOEPK) en poliestireno e inmovilizándolo en discos de vidrio. Otro método es colocar un punto de sensor de oxígeno en la parte inferior de un microbioreactor transparente y excitarlo con un LED azul-verde de onda cuadrada (505 nm). Nuevamente, con la ayuda de un amplificador de bloqueo, el cambio de fase entre la excitación y la emisión se puede medir y correlacionar con la concentración de oxígeno disuelto. Otros sensores incluyen sensores amperométricos, que pueden medir la concentración de oxígeno en función de la reducción electroquímica del oxígeno. Otro método para la detección de oxígeno y pH es mediante el uso de un sensor de microarrays de hidrogel fluorescente PEG con BCECF-dextrano.
CO2
Además, el CO2 se puede medir con un sensor óptico basado en un tinte fluorescente en una membrana de silicona.
Concentración celular (OD)
En los biorreactores, es necesario controlar la masa celular en tiempo real, generalmente por medio de métodos ópticos como la ley de Beer-Lambert o infrarrojo cercano (NIR). La densidad óptica se puede calcular a partir de una medición de transmisión utilizando un LED naranja (600 nm), una lente de colimación y un fotodetector. Otro método utiliza la espectroscopía de impedancia. Este método aplica una corriente alternativa a través del biorreactor y mide la conductividad celular en función de la frecuencia. Debido a que solo las membranas de las células vivas pueden polarizarse, las células muertas se excluyen de la medición. Los métodos para medir la densidad celular de Escherichia coli en sistemas microfluídicos incluyen la detección de quórum para observar la dinámica del cultivo celular.
Técnica de fabricación mecánica de biorreactores segunda parte.
Elastómeros
Los elastómeros consisten en cadenas de polímeros reticulados y son compresibles cuando se aplica fuerza externa, después de lo cual regresan a su forma original cuando se elimina la fuerza. El elastómero más utilizado es PMDS. Es un líquido de dos componentes, que es curable entre 40 y 80 ° C, y se puede emitir a una resolución nanométrica contra un patrón fotorresistente en una oblea de silicio. El PDMS puede unirse reversiblemente al vidrio u otra pieza de PDMS, o unirse irreversiblemente después de un tratamiento con plasma de oxígeno. PDMS es elástico, lo que permite su uso como válvulas neumáticas. Se coloca una capa delgada de PDMS (40 μm) entre dos capas de canal. Al aplicar presión sobre el canal superior, la membrana se empuja hacia el otro canal, bloqueándola efectivamente. De esta manera, se puede realizar una integración de alta densidad de válvulas (106 válvulascm − 2), así como bombas neumáticas, que se basan en tres válvulas. PDMS también es permeable a los gases, lo que lo convierte en un material excelente para sistemas de cultivo celular a largo plazo. Sin embargo, dado que el PDMS es una matriz porosa a nivel molecular, también es incompatible con solventes orgánicos, ya que adsorbe pequeñas moléculas hidrofóbicas y biomoléculas.
Termoestables
Los fotoprotectores negativos, como el SU-8 (una resina epoxi fotosensible) y la poliimida, se utilizan principalmente para moldes de microfabricación en obleas de silicio. Sin embargo, últimamente, también se han utilizado para crear microcanales. Cuando se calientan e irradian, los termosensantes se reticulan para formar redes rígidas, que son estables a altas temperaturas y resistentes a la mayoría de los solventes, a la vez que son ópticamente transparentes. También permite paredes laterales verticales con altas relaciones de aspecto. Con una unión adecuada, los dispositivos microfluídicos pueden fabricarse completamente en termoestables. Se puede lograr una buena unión entre SU8 y PDMS mediante el uso de un paso de silanización en fase gaseosa de SU8, el tratamiento con plasma de oxígeno de PDMS y el calentamiento bajo una ligera presión.
Termoplásticos
A diferencia de los termoestables, los termoplásticos se pueden remodelar después de ser curados. Se pueden remodelar varias veces recalentando alrededor de su temperatura de transición vítrea.
Los termoplásticos típicos utilizados en microfluídica son PMMA, policarbonato (PC), poliestireno (PS), tereftalato de polietileno (PET) y cloruro de polivinilo (PVC). Los termoplásticos se venden normalmente sólidos como láminas de plástico, que pueden cortarse con láser o termo-moldearse (o nanoimprimirse). Con nanoimpresión, es fácil hacer rápidamente miles de réplicas a bajo costo, pero requiere una plantilla de metal (dependiendo del tamaño de la característica, puede ser micromaquinado o fabricado con litografía de rayos X) o silicio. Este método no es muy económico para la creación de prototipos. Los termoplásticos deberán estar termoadhesivos a otros termoplásticos. Similar a PDMS, su superficie puede modificarse covalentemente, pero son más estables que PDMS. Por ejemplo, una superficie tratada con plasma de oxígeno puede mantener su hidrofilia por algunos años. Otros polímeros perfluorados de interés son TeflonPFA (perfluoroalcoxi) y TeflonFEP (etilenopropileno fluorado) ya que son extremadamente inertes a los productos químicos y solventes, antiadherentes y antiincrustantes. Además, son ópticamente transparentes, lo suficientemente suaves como para hacer valles y moderadamente permeables a los gases. Se pueden moldear térmicamente a alta temperatura (más de 280 ° C).
Hidrogeles
Los hidrogeles se parecen a la matriz extracelular (ECM) en la que las células están encapsuladas y, por lo tanto, se usan ampliamente para incrustar células. Los canales de microfluidos se pueden fabricar en los hidrogeles para suministrar soluciones, células u otras sustancias. Los hidrogeles son una red 3D de cadenas de polímeros hidrófilos con más del 99% de contenido de agua. Son altamente porosos permitiendo que las pequeñas moléculas o partículas se difundan a través de ellas. Como tal, los hidrogeles ofrecen una función similar a las vasculaturas naturales, permitiendo cultivos celulares 3D en masa. Debido a su baja densidad, los hidrogeles solo permiten características de microescala. Existen dos estrategias para estructurar hidrogeles: una está utilizando el método de escritura láser directo y la otra es la gelificación del hidrogel desde una boquilla móvil. Cuando se agregan células al hidrogel, este último se llama bioimpresión.
Papel
Últimamente, ha habido un creciente interés en la microfluídica en papel. El papel es una matriz altamente porosa hecha de celulosa con excelente capilaridad. Al hacer que ciertas áreas del papel sean hidrofóbicas, la solución acuosa puede guiarse a través de las regiones hidrofílicas por efecto capilar. Para obtener las regiones hidrofílicas, los métodos litográficos pueden aplicar una solución de polímero al papel. Otro método es cortar los canales en parafilm u otras películas de cera, y presionar el patrón en un trozo de papel con una prensa caliente. El papel tiene algunas ventajas: es barato; actúa como una bomba pasiva; el papel puede apilarse para hacer sistemas de microfluidos multicapa; y el papel puede filtrar partículas, como eliminar células sanguíneas de la sangre. También tiene algunas desventajas: el problema de evaporación del líquido de los canales abiertos; la integración de alta densidad es difícil porque el ancho mínimo del canal es de 200 μm; y el hecho de que solo se usan líquidos con tensiones de alta superficie.
Técnica de fabricación mecánica de biorreactores
El fresado con control numérico por computadora (CNC) y la microperforación pueden crear orificios de hasta 100 μm, mientras que las funciones se pueden hacer con bolas, cuadrados, taladros y fresas con asiento de llave de varios tamaños. El fresado y la perforación dejan una superficie rugosa, que se puede alisar puliendo con vapor de cloruro de metileno o con un tratamiento de superficie asistido por láser. El precalentamiento seguido de la fusión de la superficie hasta 50 μm de profundidad con un láser de CO2 desenfocado proporciona superficies extremadamente lisas, eliminando la aspereza mecánica del proceso de fresado.
Con tubos, férulas, tuercas y filtros listos para usar, es posible establecer un sistema microfluídico relativamente barato. Los componentes disponibles en el mercado, como los tubos, están disponibles con diámetros de hasta 50 μm. Al utilizar otros componentes, como uniones, uniones en T y filtros, se pueden diseñar sistemas microfluídicos. Incluso se podrían incorporar válvulas solenoides para controlar las direcciones del flujo, creando así un sistema más complejo. Un sistema de fontanería a macroescala sería la analogía.
De esta manera, mediante el uso de piezas de Delrin de dos micromecanizados con un diámetro de canal de 150 μm, se conectaron entre sí mediante tubos de teflón de 50 μm de diámetro, cubiertos con filtros con un tamaño de poro de 2 μm para poder cargar ADN cuentas funcionalizadas de cadena sencilla, se han realizado experimentos de hibridación de ADN, mientras que el evento se registró usando un tinte intercalante y un microscopio de fluorescencia estándar. Otro ejemplo es el uso de un tubo de PTFE de 500 μm de diámetro interno para realizar una proteólisis rápida para el análisis proteómico.
Mecanizado por láser
Con la reducción en los precios del mecanizado por láser, este podría ser otro método viable para biorreactores de laboratorios más pequeños. Dependiendo de la calidad del láser, se pueden procesar submicrones y cualquier material. Las cortadoras láser estándar que utilizan un láser infrarrojo solo pueden cortar una cantidad limitada de materiales, como papel, plástico, madera y cuero. En general, los materiales que no conducen muy bien el calor no pueden usarse, como el vidrio. El plástico, o PMMA (conocido como acrílico), es un buen candidato para microfluídicos y especialmente BRoC, ya que a veces tienen una cámara de reactor en el rango de milímetros. Sin embargo, para la mayoría de las cortadoras láser comerciales, el canal más pequeño que se puede hacer puede tener solo alrededor de 400 μm de ancho. Al usar un enfocador de haz opcional, podrían ser posibles características ligeramente más pequeñas, ya que esto reduce el tamaño del punto.
Para fabricar características más pequeñas en una gama más amplia de materiales, se necesitan otros tipos de láser, como un láser excimer o un láser de femtosegundo. La desventaja es que estos láseres son bastante caros.
Capas delgadas de metal
Cuando se desea fabricar sensores o calentadores en chip, se necesita un equipo que pueda depositar capas finas de metal (generalmente Au, Pt, Ti, Cr) en las superficies. Hay dos tipos de métodos: pulverización catódica y evaporación. La diferencia es la forma en que se calienta el metal. Algunos ejemplos son la epitaxia por haz molecular inducida por plasma (PIMBE) y la deposición química de vapor de metal orgánico (MOCVD).
Materiales de fabricación
El material del que está fabricado el microbioreactor influirá en sus funciones. Para realizar estas ciertas funciones significará que se debe prestar atención al material y las propiedades, como los materiales duros frente a los blandos, o las propiedades de transparencia o termo del material. Los siguientes son algunos ejemplos de materiales utilizados en dispositivos microfluídicos. Los materiales se pueden usar solos, o se puede usar una combinación de estos materiales, para formar estructuras híbridas, como intercalar un material blando entre dos duros o combinar materiales para aumentar la permeabilidad o elasticidad en ciertas regiones.
Materiales inorgánicos
Antes de que se popularizara la microfluídica, ya se usaba ampliamente, por ejemplo, el vidrio y el cuarzo se usaban para capilares para cromatografía de gases y electroforesis capilar (CE), mientras que los reactores de flujo se micromacanaron en metal. La tecnología de microfabricación desarrollada en la industria de semiconductores significó que la primera generación de dispositivos microfluídicos se fabricara en sílice o vidrio. El vidrio es ópticamente transparente y actúa como un aislante eléctrico, mientras que la sílice es transparente a la luz infrarroja, mientras que ambos son resistentes a los solventes y biocompatibles. Un problema es el alto costo de fabricación de cada chip y otro es el uso de productos químicos peligrosos, como el HF. Estos materiales no son realmente adecuados para cultivos celulares a largo plazo, ya que ni el vidrio ni el silicio son permeables a los gases.
Elastómeros y Plásticos
Existe una gran variedad de polímeros diferentes con propiedades específicas. Los polímeros son de fácil acceso y relativamente baratos y, por lo tanto, el material preferido para dispositivos microfluídicos. Los polímeros se pueden clasificar en tres grupos: elastómeros, termoestables y termoplásticos.
Reducción del biorreactor al formato microfluídico
El motivo general para reducir los biorreactores es usarlos para la optimización del proceso. Debido a su pequeño tamaño, reducen el costo, aumentan el rendimiento y reducen la mano de obra involucrada. Además, los tiempos de reacción y proceso son más cortos debido a tiempos de difusión más cortos de factores solubles. Otro factor determinante es que con dispositivos más pequeños es más fácil optimizar procesos en paralelo y que los dispositivos microfluídicos se presten para ser automatizados. Sin embargo, no están al mismo nivel de automatización que los sistemas robóticos de manejo de líquidos. Hay ejemplos reales donde los microrreactores funcionan mejor que los sistemas convencionales. Un ejemplo es la eficiencia de la digestión de la enzima inmovilizada en las paredes de un microtubo, que tuvo un mayor rendimiento en comparación con los sistemas de digestión en solución. Esto se debe a que los microfluídicos tienen una relación superficie / volumen mucho mayor que los recipientes del reactor.
Muchos de los reactores descritos en este capítulo se han comparado con reactores a escala de banco que muestran resultados similares. La cuestión de si el microbioreactor puede ampliarse a biorreactores de tamaño industrial permanece.
Métodos de microfabricación para biorreactores en un chip
Hay varias formas de fabricar un microsistema. Uno de estos procesos es la litografía suave, una técnica que es uno de los métodos más utilizados para la fabricación de microfluidos. Además, la técnica de fabricación mecánica fina es una opción, ya que los agujeros pueden perforarse hasta 100 μm de diámetro. En estos días, el mecanizado con láser es más accesible, pero para alcanzar una alta precisión se necesita un láser de alta precisión, lo que elevará el precio.
Para realizar la microfabricación, en la mayoría de los casos, se necesita una sala limpia para evitar que el polvo se deposite en el dispositivo. Dependiendo del método de fabricación utilizado, se necesita una clase diferente de sala limpia. Clase, en este caso, significa el número de partículas de polvo por metro cúbico. Para hacerse una idea, para la litografía suave se necesita una limpieza de 1000–10000partículas − 3 (ISO clase 4-5). En el otro lado de la escala está la fabricación de microelectrónica, de 1 a 10 partículas m − 3(ISO clase 1 – 2), al definir un tamaño de partícula de 0.3 μm.
Grabado de silicio / vidrio
Aunque el vidrio podría ser el material más deseado para usar en aplicaciones de biotecnología debido a sus propiedades ópticas y compatibilidad biológica, es un material difícil de procesar debido a su fragilidad. Existen algunos métodos para procesar el vidrio: granallado en polvo, grabado profundo con iones reactivos (DRIE), grabado húmedo y mecanizado con láser. De todos estos métodos, el grabado húmedo con HF da buenos resultados, a pesar de que es un proceso isotrópico, pero es el más peligroso de los métodos, que no se recomienda para un laboratorio estándar, ya que son necesarias normas especiales de capacitación y seguridad. Además, no todos los laboratorios permiten HF en sus instalaciones. DRIE es un método de grabado muy lento, y el equipo es muy costoso, lo que no siempre está disponible en salas limpias. Sin embargo, el proceso puede ser extremadamente preciso para características pequeñas (0.5 μm). La voladura de polvo también dará resultados significativos, excepto que las paredes se ahusan en un ángulo de aproximadamente 12-15∘, pero el tamaño mínimo de la característica es de alrededor de 50 μm.
Litografía suave
Desde la introducción de la litografía suave ha provocado el despegue de la microfluídica. Es un método de moldeo de réplica relativamente barato con una alta rotación posible. Sin embargo, la obtención de un molde requeriría el uso de una sala limpia equipada con litografía, que es básicamente un alineador de máscara (u otra fuente de luz UV; [42]), un recubrimiento por rotación, placas calientes y un banco de solventes. La fotorresistencia más utilizada es SU8, que está disponible en diferentes viscosidades, lo que da como resultado diferentes alturas de características. Dependiendo del tamaño de la función, hay diferentes opciones de máscara. Para todo lo que supere los 20 μm, se pueden imprimir máscaras de aluminio. Para características entre 5 y 20 μm, se necesitan máscaras de soda-lima (∼ $ 500–1000, dependiendo de la cantidad de características en el). Para características entre 0.5 y 5 μm, se necesitan máscaras de cuarzo (> $ 1500). Para tamaños de características más pequeños, el proceso se vuelve un poco más complicado al usar un paso a paso, que básicamente reduce los tamaños de características en la máscara al transferir ópticamente el patrón a través de una lente.
Estampado en caliente
Para ampliar la producción, se podría considerar la impresión. Este método utiliza plásticos, como PMMA (o acrílico) para hacer chips en grandes cantidades mediante el uso de un molde de silicio o metal para presionar bajo presión en plástico calentado. Los tamaños de características en el rango submicrónico se pueden replicar. Este método solo es recomendable para la producción a gran escala, no para procesos de desarrollo rápido.
Biorreactores – Ventajas de los microsistemas
Los sistemas biológicos están en la escala de micrómetros si observamos las propiedades de transporte fluídico y difusivo. Como tal, los biorreactores microfabricados tienen mucho sentido, ya que pueden imitar estas propiedades in vitro. Los dispositivos en el rango micro necesitan menos espacio, menos reactivos y menos energía, mientras que los tiempos de respuesta y, por lo tanto, las tasas de reacción aumentan. Hay una ganancia en la información sobre el espacio, en comparación con los equipos estándar, lo que también reduciría los costos. Una ventaja importante de los sistemas microfluídicos es la posibilidad de un alto rendimiento, que se requiere para tener una gran cantidad de ejecuciones del sistema para obtener datos estadísticamente significativos. Esto se aplica especialmente a los microbioreactores de perfusión microbiana en los que ha habido un progreso significativo en la implementación de alto rendimiento.
Otra ventaja de los microsistemas es la posibilidad de construir microambientes específicos de células debido al control preciso de las estructuras de microescala. La capacidad de controlar, por ejemplo, el patrón de flujo, proporciona control sobre el transporte de factores de crecimiento, reactivos, oxígeno y la cantidad de estrés hidrodinámico en las células. El tamaño de la cámara del biorreactor afectará el comportamiento de las células, alterando los fenómenos de transporte, debido a las distancias de difusión y las interacciones célula-célula. La velocidad de flujo puede tener un efecto en la dinámica de crecimiento celular. Por ejemplo, en un experimento, los fibroblastos se cultivaron bajo diversas condiciones de flujo en un microbioreactor: desde condiciones estáticas (sin flujo) hasta altas tasas de flujo. Las células mostraron poco crecimiento en condiciones sin flujo o en flujo alto (0.3mlh − 1), pero mostraron un crecimiento óptimo a 0.2mlh − 1. Las células madre embrionarias mostraron el mismo comportamiento hacia las tasas de flujo. No solo se ve afectado el crecimiento celular, sino también la viabilidad. Esto muestra que el microambiente impacta las funciones celulares y, por lo tanto, la respuesta de toxicidad hacia las drogas. El cultivo de células en un entorno microfluídico en un sistema perfundido continuo ofrece la capacidad de controlar la interacción de los medios celulares al producir un gradiente químico en estado estable, en comparación con el sistema de cultivo estándar donde la composición química cambia con el tiempo. En condiciones estáticas, la difusión es el método de transporte masivo dominante.
Las células pueden estar en contacto directo con un flujo o estar protegidas por una barrera microfabricada, sustrato de micro-ranura, oxigenadores de membrana internos o hidrogeles. Cuando está protegido, el efecto del esfuerzo cortante todavía está presente, pero en menor magnitud que cuando las células están en contacto directo con el flujo. Los cultivos celulares deben perfundirse para refrescar el medio de cultivo, pero las células también deben incubarse en factores solubles secretados, como las células alimentadoras para cultivos de células madre embrionarias humanas (hESC). Un flujo eliminaría estos factores. Un método que facilita el cultivo a largo plazo (> 7 días) en flujo directo es usar un sistema de perfusión de “parada de flujo”: una exposición temporal corta seguida de largos períodos de incubación estática. Pulsos cortos de cizallas permitirían que las células sensibles al cizallamiento (como las hESC) soporten flujos de renovación medios, mientras que los largos períodos de incubación estática permitirían la acumulación local de factores secretados (es decir, factores de crecimiento). El método de «detención del flujo» podría ser adecuado para cultivar diferentes cultivos celulares con diferentes reacciones al esfuerzo cortante en el mismo microbiorreactor, cuando se expone directamente al flujo. Como tal, el protocolo de «parada baja» debe diseñarse de acuerdo con los requisitos de cultivo celular. En estas condiciones, las células se asemejan a las características convencionales del plato de cultivo.
Como tal, el protocolo de «parada baja» debe diseñarse de acuerdo con los requisitos de cultivo celular. En estas condiciones, las células se asemejan a las características convencionales del plato de cultivo. Los microbioreactores reducirían en gran medida la carga útil. También muestra que los sistemas de cultivo de células microfluídicas pueden ser autónomos.
Una ventaja importante de los sistemas microfluídicos es la capacidad de crear gradientes de concentración de productos químicos dentro del microbioreactor utilizando flujos laminares. Básicamente, un generador de gradiente es una serie de canales con diferentes contenidos fluídicos conectados a una cámara donde se forma el gradiente. Debido al carácter laminar de los flujos dentro de los microcanales, la mezcla solo ocurre por difusión. Una forma simple de formar un gradiente de concentración es tener dos soluciones fluyendo en un microcanal. Esto crea un flujo paralelo, que se mezclará lentamente por el canal. También se han desarrollado otros tipos de gradientes de concentración más complejos, incluidas las distribuciones lineales, sigmoidales y logarítmicas. La formación de gradientes de concentración en sistemas de pozos múltiples no es sencilla ya que las dosis deben crearse en diferentes pozos. Otra aplicación del generador de gradiente es la creación de dosis combinatorias de medicamentos, para lograr efectos más sinérgicos y establecer la relación óptima entre los medicamentos. Un ejemplo es probar el efecto de varias concentraciones de anestésicos, bupivacaína y lidocaína en los mioblastos. Tal control sobre las entregas de reactivos a concentraciones definidas muestra el potencial de BRoC que no se puede lograr fácilmente con plataformas de micropocillos convencionales.
También se puede lograr un gradiente de oxígeno a través de un microbiorreactor controlando la velocidad de flujo, para exponer las células al ambiente heterogéneo de oxígeno. A medida que el oxígeno se consume al comienzo del microrreactor donde entra el medio, quedará menos oxígeno en el otro extremo del microrreactor en la salida. El gradiente de oxígeno en el microrreactor imita las condiciones fisiológicas en los tejidos, por ejemplo, el hígado, donde las funciones localizadas en el hígado controlan la concentración local de oxígeno.
Biorreactores en un chip
Comprender el comportamiento de las células y sus funciones durante el crecimiento y la producción, y la relación con el suministro de nutrientes es esencial en el campo de la biotecnología. La mayoría de los sistemas convencionales de cultivo celular funcionan en modo discontinuo, en el que se proporciona una cantidad fija de nutrientes y oxígeno para el cultivo celular inicial, lo que apoya el crecimiento hasta que faltan nutrientes y oxígeno.
Esto significa que debido al cambio constante en el ambiente, los cultivos discontinuos no son ideales para caracterizar y brindar una mejor comprensión de los procesos celulares. En cambio, es necesario un entorno más constante y controlado con precisión. El principio del quimiostato lo proporciona por su suministro continuo de nutrientes y oxígeno. A diferencia de los cultivos discontinuos, los cultivos de quimiostato continuo pueden funcionar durante semanas en estado estacionario. Sin embargo, el consumo y el costo de los medios de crecimiento, hasta 500 litros por cultivo de quimiostato para un reactor a escala de banco, no es realista, y mantener el sistema estéril durante la adición de medio o el muestreo es otro problema.
La microfluídica puede ofrecer una forma de abordar estas dificultades. Un sistema de biorreactor basado en microfluidos consumirá del orden de 10 ml a 1 l, en lugar de 500 l. La posibilidad de integración de sensores ópticos o electrónicos para medir y controlar diversas condiciones ambientales, así como la integración del manejo de fluidos, como bombas y válvulas y la posibilidad de paralelismo masivo, pueden dar a los biorreactores basados en microfluidos una ventaja que los biorreactores convencionales hacen no tienen.
Los microbioreactores tienen una cámara de reactor con volúmenes de alrededor de 50 a 800 μl, mientras que los biorreactores a escala de banco tienen un volumen típico de 0.5 a 5l . Algunas ventajas de los microbioreactores son la cantidad reducida de sustrato y las utilidades necesarias por experimento y los requisitos de espacio reducido para la operación en paralelo. Como estos dispositivos son desechables, también reducen los esfuerzos para prepararse para el experimento, ya que no tienen que limpiarse y esterilizarse después de su uso. Además, la automatización se hace más fácil.
Se obtiene una variedad de bioproductos a través del proceso de fermentación microbiana. Los productos pueden incluir metabolitos primarios, metabolitos secundarios, enzimas, proteínas terapéuticas y vacunas. El desarrollo de estos productos comienza con una fase de selección en la que muchas cepas bacterianas potenciales se seleccionan para obtener el mayor rendimiento del producto en ciertas condiciones de crecimiento. Cuando se identifica un candidato microbiano, la cepa se transfiere a la fase de desarrollo donde se estudia la fisiología de la cepa con más detalle, al igual que las condiciones de crecimiento en biorreactores a escala de banco con volúmenes de 0.5 – 10 l. La etapa final es una ampliación del volumen del biorreactor hasta alcanzar la escala de producción.
El cuello de botella de tiempo y trabajo en este trabajo de desarrollo es la fase de selección. Típicamente, los experimentos se llevan a cabo utilizando una combinación de placas de pocillos múltiples, placas de Petri y matraces de agitación. Estos medios convencionales permiten solo un control limitado del microambiente, y solo se pueden obtener datos de punto final del rendimiento de las células.
Una cuestión clave es que las células en los biorreactores deben agitarse para obtener un ambiente de cultivo más homogéneo, reduciendo los gradientes espaciales de los factores solubles. Esto es válido para los biorreactores de suspensión a gran escala, así como para los microbioreactores en el rango de microlitros. En este último caso, la agitación se puede lograr utilizando barras agitadoras magnéticas o termoconvección impulsada por flotabilidad. Las barras agitadoras magnéticas pueden ser útiles cuando se usan biorreactores individuales, pero cuando se usan muchos microbioreactores en paralelo, este método será más difícil de controlar. El método de termoconvección se ha aplicado a un formato de placa de 96 pocillos. La convección se logra colocando un calentador microfabricado debajo de cada pozo y creando una diferencia de temperatura de hasta 4 4°C. Se afirma que solo el 5% de la evaporación del medio se detectó después de 7 días. Sin embargo, cuando un cultivo se perfunde con medios en un sistema de cultivo de células microfluídicas, no hay necesidad de un agitador. Las distancias de difusión dentro de un microbioreactor verdadero son muy cortas, hasta 100 μm. Como tal, habrá una condición de cultivo celular como se encuentra en los tejidos in vivo. La pregunta es, por supuesto, ¿cuál es el objetivo del cultivo celular: imitar la fisiología in vivo u optimizar un cultivo celular para obtener el mayor rendimiento de los productos, sin tener en cuenta las similitudes in vivo? La respuesta es la siguiente: si las drogas se prueban para consumo humano, la primera situación es esencial; Si las drogas se producen por medio de cultivos de células microbianas, es preferible la última situación.
Existe la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías de cultivo de células microbianas de manera de alto rendimiento para mejorar nuestra comprensión de las funciones de los microorganismos en diferentes condiciones ambientales. Los biorreactores industriales y de escala de banco tienen la capacidad de controlar y medir la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto (OD), el CO2 y las densidades celulares (OD). Sin embargo, estos biorreactores son caros y también requieren mucho tiempo para funcionar en lotes paralelos. El creciente número de permutaciones genéticas y de procesos y optimizaciones necesarias para detectar nuevos productos necesitará formas más rápidas de recopilar todos esos datos. Los volúmenes de reactores más pequeños combinados con sensores integrados con un flujo de datos en tiempo real facilitarían la detección rentable y de alto rendimiento. Aunque la escala de banco ofrece algunos parámetros en tiempo real, como el OD y el pH, la biomasa todavía se mide fuera de línea, lo que aumenta la contaminación y reduce el volumen durante los experimentos. Esto conduce a condiciones de proceso alteradas. Los tubos y los matraces de agitación, que representan más del 90% de todos los experimentos de cultivo celular en biotecnología, se pueden operar en paralelo con volúmenes más pequeños, pero los datos solo se recopilan en el punto final. Reducir aún más los microbioreactores podría conducir a sistemas tales como matrices de microfermentadores o kits de análisis microbiológicos.
Medición DOT y pH en biorreactores
El DOT y el pH de un caldo de cultivo representan dos de los parámetros de proceso más importantes en los cultivos biológicos. Los parámetros son indispensables para una caracterización fundamental de los bioprocesos. Para los matraces de agitación, se han informado puntos del sensor DOT autoclavables para mediciones de fluorescencia óptica. Estos sensores contienen un tinte de luminiscencia sensible al oxígeno. La concentración de oxígeno se determina mediante mediciones de por vida del luminóforo. Un desafío de la medición de DOT en el matraz de agitación es que las manchas tienen que estar cubiertas continuamente por medio de cultivo para evitar errores de medición. En particular, a altas frecuencias de agitación y bajos volúmenes de llenado, no hay una ubicación en el matraz que esté continuamente cubierta por el líquido a granel giratorio. Existen puntos de sensores similares para mediciones DOT en placas de microtitulación. La señal de fluorescencia se detecta de forma no invasiva mediante un cable de fibra óptica. En las placas de microtitulación, el líquido comúnmente cubre el fondo total durante la agitación. Potzkei desarrolló otro sensor para la medición de oxígeno en células vivas. Este sensor se basa en la transferencia de energía de resonancia de Förster codificada genéticamente (FRET). Consiste en una fluorescente amarilla y una proteína fluorescente basada en el mononucleótido flavina (YFP-FbFP). Si hay oxígeno presente, se forma y madura YFP. En consecuencia, la intensidad de fluorescencia de FbFP medida disminuye debido a una transferencia de energía no radiactiva entre los cromóforos de FbFP y YFP. El sensor se aplicó con éxito para el monitoreo continuo en tiempo real de los cambios temporales de los niveles de O2 en el citoplasma de las células de E. coli durante un cultivo por lotes.
Para las mediciones de pH, hay disponibles sensores similares para matraces de agitación y placas de microtitulación. Las manchas se basan en la medición de fluorescencia y contienen un tinte fluorescente sensible al pH. El rango de medición del pH óptico está limitado a un rango de pH = 4.5 – 8.5. En la literatura se describe un dispositivo comercial para mediciones en línea de DOT y pH en matraces de agitación. Badugu y col. desarrolló una película de sensor de pH óptico radiométrico para bioprocesos, que puede miniaturizarse fácilmente. Es aplicable en placas de micropocillos y microbioreactores. El sensor se basa en un derivado de alilhidroxiquinolinio copolimerizado con polietilenglicol. Tiene dos máximos de excitación a 𝜆ex, 1 = 375 nm y 𝜆ex, 2 = 425 nm con un pico de emisión único a 𝜆em = 520 nm y puede usarse para determinar los valores de pH en el rango de pH = 5-8. La respuesta de pH de este sensor no es sensible a la fuerza iónica y la temperatura del medio.
Un método técnicamente simple para determinar el pH en soluciones acuosas en biorreactores es el uso del colorante fluorescente HPTS (sal trisódica del ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico). HPTS es soluble en agua y se puede agregar a una solución acuosa. Dependiendo del pH prevaleciente, cambia la intensidad de fluorescencia de HPTS. Una aplicación exitosa de este colorante para determinar el pH en pozos de microtitulación se informa en la literatura. Los autores realizaron una medición ratiométrica. A dos longitudes de onda de excitación de 𝜆ex, 1 = 405 nm y 𝜆ex, 2 = 450 nm, la intensidad de emisión de fluorescencia se mide a 𝜆em = 520 nm, y se calcula la relación de ambas intensidades de emisión. Esta medición radiométrica reduce en gran medida los errores de medición debido al hecho de que las posibles alteraciones de la fuente de luz, los detectores ópticos y los ligeros cambios en la transmisión de luz a través de las fibras ópticas se compensan casi por completo. Además de la medición radiométrica, la referencia dual de por vida (DLF) es un método altamente preciso para realizar mediciones de fluorescencia. En ese caso, se mide el ángulo de fase de dos señales de fluorescencia estimuladas periódicamente.
Mientras que un tinte es un tinte de referencia insensible al pH, el segundo es sensible al pH. Si el pH cambia, el ángulo de fase del tinte sensible al pH también cambia, mientras que el ángulo de fase del tinte de referencia permanece constante. Finalmente, el pH puede determinarse a partir del cambio del ángulo de fase general medido. Este método es muy preciso y se minimizan los posibles errores, como las desviaciones de la señal del dispositivo de medición o la variación de la concentración de colorante, por ejemplo, el blanqueo. Kunze y col. Señaló que la medición de pH y DOT puede volverse incorrecta si las señales fluorescentes de los sensores ópticos están influenciadas por proteínas fluorescentes en el cultivo. Si los espectros de excitación de las proteínas fluorescentes en el caldo de cultivo, y los optodos de pH y DOT son similares y, además, la longitud de onda de emisión de fluorescencia de las proteínas es similar a la longitud de onda de emisión de los optodos, DOT y la señal de pH puede ser incorrecto.
Monitoreo y Control de Microbioreactores
El monitoreo de los parámetros biológicos es esencial para un análisis de proceso sistemático y resultados de detección razonables. Los parámetros relevantes, como la temperatura, el pH, el DOT, el OTR y las señales para la formación de biomasa y productos, son necesarios para la optimización y la ampliación del proceso. Para caracterizar integralmente un bioproceso, se deben aplicar diferentes condiciones de operación y mediciones. Los parámetros de operación deben aplicarse en diferentes combinaciones para cubrir una amplia gama de condiciones de cultivo. Esta variación de los parámetros operativos implica experimentos laboriosos y que requieren mucho tiempo. Para reducir el esfuerzo experimental y ahorrar tiempo, se puede utilizar DoE. La cantidad de datos de proceso obtenidos aumenta y, simultáneamente, el esfuerzo experimental se minimiza si se aplica DoE.
Actualmente, se encuentran disponibles diferentes sensores fisicoquímicos y diversas técnicas de medición para sistemas de microbiorreactores. Los sensores fisicoquímicos generalmente se pueden aplicar en biorreactores a escala de banco sin mayores restricciones, mientras que la aplicación en biorreactores a pequeña escala es más difícil debido a los pequeños volúmenes de los vasos y al poco espacio dentro del biorreactor. Debido a estos desafíos, las técnicas de medición óptica a menudo se aplican en microbioreactores. La viabilidad de mediciones no invasivas, diseño miniaturizado y tiempos de respuesta rápidos hace que estas técnicas sean aptas para aplicaciones en biorreactores a pequeña escala. Además, la medición óptica integrada permite un diseño continuo del proceso sin interrumpir el cultivo microbiano durante las mediciones en microbioreactores agitados. Por ejemplo, se pueden realizar mediciones de luz dispersa y fluorescencia sin interrumpir el proceso de agitación durante un cultivo microbiano en microbiorreactores. Por ejemplo, se pueden realizar mediciones de luz dispersa y fluorescencia sin interrumpir el proceso de agitación durante un cultivo microbiano en microbiorreactores. Por lo tanto, se proporcionan condiciones de cultivo óptimas durante todo el tiempo de cultivo. Otro inconveniente de la técnica de medición invasiva, por ejemplo, la medición del pH con electrodos electroquímicos, es la alteración de la hidrodinámica del líquido dentro de los biorreactores. Como consecuencia, el cultivo cultivado puede verse afectado negativamente. En particular, a pequeños volúmenes de líquido, la influencia de los sensores en el líquido hidrodinámico podría volverse crítica. Por lo tanto, se prefieren las mediciones de luz dispersa y fluorescencia para determinar la biomasa y la formación de productos en placas de microtitulación. Se requieren proteínas fluorescentes específicas para controlar ópticamente la formación del producto. Las proteínas fluorescentes están unidas como etiquetas de fusión a las moléculas objetivo deseadas en microorganismos modificados genéticamente. Las etiquetas de fusión convencionales son la proteína fluorescente verde (GFP) y sus derivados, es decir, la proteína fluorescente amarilla (YFP), las proteínas fluorescentes a base de mononucleótidos de flavina (FbFP) y las etiquetas de triptófano. Las mediciones de fluorescencia también se utilizan para determinar el pH, el O2, el CO2 y el NH4. Samorski desarrolló un dispositivo de cultivo para placas de microtitulación basado en luz óptica dispersa y mediciones de fluorescencia. En este dispositivo, la placa de microtitulación se coloca sobre una mesa de agitación en una cámara de cultivo templada. Un cable de fibra óptica se mueve a través de una unidad x – y debajo de la placa de microtitulación y realiza mediciones ópticas automáticas de pocillos individuales de la placa de microtitulación. Este BioLector, llamado tecnología de medición, fue ampliamente validado y está disponible comercialmente en la empresa m2p-labs GmbH, Baesweiler, Alemania. Un prototipo de este dispositivo se utiliza en la Cátedra de Ingeniería Bioquímica de la Universidad RWTH Aachen. Con ese dispositivo, es posible el cultivo paralelo de hasta cuatro placas de microtitulación. Si se utilizan placas de 96 pocillos, en total 384 cultivos monitoreados en línea a través de luz dispersa y las mediciones de fluorescencia pueden realizarse en paralelo.
Las mediciones de fluorescencia se pueden utilizar para determinar los perfiles de temperatura cualitativos en microbioreactores. Sin embargo, la medición precisa de la temperatura absoluta es más difícil. En microbioreactores agitados o chips microfluídicos, la temperatura se mide típicamente con termistores, detectores de temperatura de resistencia o termopares. Sin embargo, en los sistemas sacudidos, la medición y el control de la temperatura se integran comúnmente en la cámara de incubación en la que se coloca el microbiorreactor. Un control individual de los pocillos individuales en la placa de microtitulación agitada es complejo y costoso. Hasta ahora, solo se conoce un control de temperatura bien específico para un sistema comercial para placas de microtitulación agitadas (micro-matriz (anterior: 𝜇24).