Alimentación controlada por enzimas del microbiorreactor
Un método enzimático es un método técnico simple, económico y fácil de aplicar para alimentar glucosa en microbiorreactores. En este enfoque, se añaden al medio de cultivo almidón y enzimas hidrolíticas, como la amilasa y la maltasa. La amilasa descompone el almidón en glucosa y maltosa. La maltosa se convierte en glucosa por la maltasa. A concentraciones de almidón suficientemente altas, la tasa de liberación de glucosa depende de la cantidad de enzimas activas en el caldo de cultivo. Se puede ajustar fácilmente cambiando la concentración de la enzima. Este método de liberación de sustrato enzimático se aplicó en un sistema de entrega automática de sustrato disponible comercialmente. En este sistema, se utiliza un gel de dos fases. La primera capa de agar contiene almidón. Sobre la primera capa, se coloca una segunda capa de agar sin almidón para mejorar el control de liberación si el almidón se difunde fuera del agar. El gel de agar de dos fases se puede fijar en el fondo de los matraces de agitación o las placas de microtitulación. En presencia de glucoamilasas, el almidón se degrada a glucosa, que es metabolizada por los microorganismos. Un inconveniente del sistema de liberación de sustrato enzimático es que está limitado a la glucosa como sustrato. Este sistema no se puede utilizar para microorganismos productores de amilasa, ya que, en presencia de otras amilasas, la liberación de glucosa se volverá indefinida. Además, si hay proteasas presentes durante el cultivo, la glucosidasa puede degradarse y, posteriormente, se inhibe la liberación del sustrato. Debe observarse que los valores óptimos de temperatura y pH pueden limitar significativamente la aplicabilidad de un sistema de liberación de sustrato enzimático. Se desarrolló una versión mejorada de este sistema de liberación enzimática de glucosa. En lugar de usar una fase de gel, se usa un polímero que es completamente soluble en soluciones acuosas. Los cultivos de P. pastoris con un promotor AOX1 inducible por metanol se realizaron con éxito utilizando este sistema de liberación mejorada. Al aplicar la alimentación enzimática de glucosa, se han evitado las fases de inanición de carbono entre los pulsos de metanol comúnmente aplicados. Como resultado, se alcanzaron mayores densidades celulares y una actividad del producto tres veces mayor (lipasa fúngica). También se usó un sistema de liberación de glucosa controlado enzimáticamente para el cultivo de P. pastoris alimentado por lotes. En esta aplicación, se usó un medio de cultivo basado en un medio Syn6, que contiene un polímero de glucosa soluble. Después de la adición de glucosidasa al medio de cultivo, se inicia la liberación de glucosa.
Alimentación de microbiorreactores continuos por bombas nitiadas.
Un cultivo continuo de microorganismos tiene algunas ventajas en comparación con el modo de operación de biorreactores por lotes o por lotes. Los biorreactores operados de manera continua) proporcionan condiciones de cultivo constantes (estado estable) durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, son adecuados para investigar y cuantificar las propiedades específicas de las cepas microbianas debido al hecho de que algunos microorganismos reaccionan de manera sensible a los cambios del medio ambiente. Para los bioprocesos continuos convencionales, se utilizan principalmente biorreactores de tanque agitado. Para garantizar una condición de cultivo similar en la producción y el cribado, la aplicación de microbiorreactores con agitación es altamente adecuada. Sin embargo, los microbiorreactores con agitación tienen costos de inversión relativamente altos y son apenas adecuados para aplicaciones de alto rendimiento. El tiempo para alcanzar el equilibrio y las condiciones de operación en estado estable es demasiado largo para la detección eficiente de microorganismos. En contraste, los sistemas continuos de microbiorreactores agitados ofrecen la posibilidad de una experimentación rápida y rentable de alto rendimiento. Los cultivos continuos paralelos pueden llevarse a cabo en un sistema de biorreactor de agitación paralela continua (CosBios) presentado por Akgün. La alimentación de una bomba peristáltica multicanal se aplica en este sistema. Se obtiene un gran número de datos experimentales en un experimento si se ajustan diferentes condiciones de operación en los recipientes de cultivo agitados en paralelo. Se demostró que los resultados de los cultivos de S. cerevisiae en este sistema concuerdan bien con los resultados obtenidos en un biorreactor de tanque agitado de 1 litro operado de manera continua. La concentración de biomasa de un cultivo continuo de C. glutamicum en el sistema de biorreactor CosBios se representa sobre la tasa de dilución. Hasta una tasa de dilución de aproximadamente 0,38 h − 1, el valor de la concentración de biomasa es constante en 5 g l − 1y la concentración de glucosa está cerca de 0gl − 1. A tasas de dilución más altas, el lactato se forma debido a la limitación de oxígeno. Simultáneamente, la concentración de biomasa disminuye y la concentración de glucosa aumenta debido a la reducción del crecimiento microbiano en la limitación de oxígeno. Recientemente, el sistema de biorreactor continuo agitado en paralelo se extendió y se aplicó con éxito en cultivos repetidos de bacterias para la producción de vinagre. Se demostró que los sistemas permitían un cultivo totalmente automatizado y rentable de ocho cultivos en lote repetidos paralelos.
Alimentación por lotes y operación continua de micro-biorreactores
Los bioprocesos industriales a menudo se llevan a cabo en modo alimentado por lotes o en modo de funcionamiento continuo. Los bioprocesos industriales a menudo se llevan a cabo en modo alimentado por lotes o en modo de funcionamiento continuo. Ambos modos de operación se utilizan para superar la inhibición del sustrato, la represión catabólica o el metabolismo de desbordamiento. El suministro limitado de sustrato es adecuado para evitar la limitación de oxígeno a altas densidades celulares. Además, las condiciones óptimas para el crecimiento y la formación del producto se pueden ajustar mediante la aplicación apropiada del modo de operación de alimentación por lotes. Finalmente, un problema a menudo subestimado en la detección es el crecimiento no paralelo de cultivos discontinuos debido a un protocolo de tiempo fijo. Los modos de operación de alimentación por lotes son adecuados para igualar el crecimiento en precultivos y, posteriormente, para asegurar la misma condición de cultivo inicial para los microorganismos en los cultivos principales. A diferencia de las condiciones de los lotes alimentados en los procesos de producción, los experimentos de selección en microbiorreactores se realizan comúnmente en modo de lotes. La diferencia fundamental entre ambos modos de funcionamiento puede llevar a una selección errónea de las deformaciones. Como consecuencia, las modificaciones del proceso pueden llegar a ser necesarias en un momento posterior y el desarrollo del proceso será menos eficiente. Para superar este problema, actualmente se desarrollan e investigan sistemas de detección de lotes alimentados.
Alimentación controlada por difusión del microbiorreactor
Una forma técnicamente simple y rentable de proporcionar condiciones de cultivo de lotes alimentados en pequeña escala es la liberación controlada de difusión de sustratos en el caldo de cultivo. La ventaja de los sistemas impulsados por difusión es que no se necesitan equipos técnicos adicionales, como bombas y válvulas. Este enfoque es aplicable a cualquier valor de pH. Jeude y otros investigadores presentaron una técnica de selección paralela para microbiorreactores basados en discos de elastómeros que se cargaron con glucosa. La glucosa sólida se incrusta en una matriz de silicona y el disco de polímero se agrega al caldo de cultivo. Si el agua se difunde en la matriz de silicona, la glucosa disuelta se difunde fuera del elastómero de silicona y el sustrato se libera en el caldo de cultivo. La liberación del sustrato se ajusta por la concentración del sustrato en el elastómero, las propiedades de la silicona y la geometría del disco. Este sistema se aplicó con éxito en matraces de agitación y placas de microtitulación. Se demostró que el metabolismo de desbordamiento de Hansenula polymorpha podía reducirse y se alcanzó un aumento del rendimiento de biomasa del 85%. Además, la formación de GFP aumentó 35 veces en el medio mineral Syn6-MES e incluso 420 veces en el medio mineral YNB en comparación con los cultivos discontinuos con la misma cantidad de glucosa totalmente metabolizada. Se utiliza un diseño ligeramente diferente de este sistema de alimentación en placas de 96 pocillos, en las cuales la matriz de silicona se fija en el fondo de cada pozo. Con ese sistema se han llevado a cabo exitosos cultivos de H. polymorpha en lotes alimentados. En lugar de glucosa, Scheidle encapsuló carbonato de sodio Na2CO3 en la matriz de silicona para controlar el valor de pH en cultivos de E. coli en matraces de agitación. Además, otros sustratos sólidos se pueden incrustar en la matriz de elastómero. Sin embargo, los líquidos, como por ejemplo el glicerol, no pueden ser alimentados. Un enfoque técnico similar para la alimentación de sustratos fue utilizado por Hegde. Los discos de hidrogel, hechos de hidrogel de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), se cargaron con glucosa e hidrolizado de proteínas para el cultivo alimentado por lotes de células CHO en matraces de agitación.
Bähr presentó un enfoque técnico diferente para la liberación de sustratos controlada por difusión. Este sistema de biorreactores consiste en un matraz de agitación para diálisis, compuesto por un matraz Erlenmeyer convencional y un depósito de sustrato tubular central. El depósito de sustrato se coloca en el centro del tapón de rosca. Al final, el depósito de sustrato se sella con una membrana fijada en una punta. La membrana gira sincrónicamente con el líquido dentro del matraz durante la agitación, y por lo tanto, se asegura el contacto permanente entre la membrana y el líquido. La alimentación de líquidos y sustratos sólidos disueltos es posible con ese sistema. La velocidad de difusión del sustrato se puede ajustar por la concentración de alimentación del sustrato y la geometría y las propiedades de la membrana. Otro sistema de alimentación impulsado por difusión es la placa de microtitulación de alimentación por lotes desarrollada recientemente. En esa placa de microtitulación, la mitad de los pozos sirven como depósitos de sustrato, mientras que la otra mitad sirve como pozos de cultivo. Un depósito de sustrato está conectado a un pozo de cultivo a través de un canal de hidrogel. Se utiliza una placa inferior especial con canales, en la que se llena el hidrogel. El sustrato se difunde desde el depósito de sustrato hacia el canal de hidrogel y, además, hacia el pozo de cultivo. La velocidad de difusión depende de la concentración de alimentación del sustrato, la geometría del canal y las propiedades del hidrogel. Una ventaja de este sistema es que el tiempo, que necesitan las moléculas de sustrato para pasar el hidrogel, se puede ajustar mediante la elección adecuada de la longitud del canal. De este modo, se puede definir el momento en que comienza la alimentación del sustrato de los microorganismos. Este sistema de alimentación, aplicable para casi cualquier sustrato, fue probado con éxito en cultivos de E. coli y H. polymorpha.
Robótica para Microbiorreactores
En los últimos años, los experimentos de detección altamente automatizados ganaron cada vez más importancia en los laboratorios de investigación y la industria. La determinación cuantitativa de los parámetros del proceso es una tarea fundamental para optimizar las cepas y las condiciones de cultivo durante el desarrollo de bioprocesos. Sin embargo, el número de posibles combinaciones de parámetros crece exponencialmente con cada parámetro adicional. La automatización del manejo del microbiorreactor puede reducir en gran medida el esfuerzo de trabajo y ampliar el rango de variables de proceso a examinar. Se puede realizar un gran número de experimentos paralelos con una tasa de errores experimentales minimizada y una alta precisión combinando sistemas robóticos con dispositivos de cultivo de microbiorreactores de alto rendimiento. El sistema robótico realiza fácilmente la toma de muestras, los análisis analíticos, el procesamiento posterior o la preparación de medios. Para determinar parámetros de proceso importantes y reducir costos, se aplica el diseño de experimentos. Las investigaciones más recientes sobre la automatización de los reactores microbiológicos tratan sobre la replicación de toda la cadena de procesos en bioprocesos a pequeña escala.
En los últimos años se han publicado varias investigaciones sobre la automatización de los reactores microbiológicos. Puskeiler integró un biorreactor miniaturizado agitado y un lector de placa de microtitulación en un sistema de manejo de líquidos. Las muestras se toman automáticamente y se pipetean en una placa de microtitulación de muestra en una unidad de refrigeración. Un brazo robótico transfiere la placa al lector para los análisis en línea y la coloca para su reutilización después del lavado. El control del pH se realiza mediante la adición de una solución de titulación. Zimmermann y Rieth presentaron un sistema de cultivo completamente automatizado encerrado en una cámara con control de temperatura y humedad que permite el cultivo de 768 experimentos en paralelo. Este sistema cubre todos los pasos desde la preparación, el cultivo, el monitoreo mediante mediciones de fluorescencia en un lector de placas externo, el procesamiento posterior (centrifugación) y el almacenamiento (congelador). Incluso el sellado estéril de las placas de microtitulación se realiza automáticamente mediante el sistema robótico. presentó un sistema totalmente automatizado con autoclave integrado y almacenamiento de soluciones de almacenamiento.
Para evitar interrupciones en el proceso de cultivo durante la toma de muestras, Huber desarrolló un sistema de cultivo automatizado que combina un sistema de manejo de líquidos, un gabinete de flujo de aire laminar y un dispositivo BioLector para mediciones de luz dispersa y fluorescencia en línea en cultivos de placas de microtitulación. Una gran ventaja de este sistema es el cultivo continuo sin interrupción durante las mediciones ópticas. Por lo tanto, la calidad de los datos aumenta y se puede obtener una gran cantidad de parámetros de proceso en poco tiempo. Este sistema se utilizó para realizar la inducción automatizada basada en la concentración de biomasa de diferentes cultivos de E. coli para asegurar un estado de crecimiento idéntico de todos los cultivos microbianos. Así, incluso en diferentes cinéticas de crecimiento de los microorganismos, la formación del producto al final del cultivo fue comparable entre sí.
La desviación de la formación del producto se redujo a ± 7%. Para mejorar la productividad de los microorganismos, se utilizaron perfiles de inducción con diferentes concentraciones de inductor y tiempos de inducción. Además, se pueden compensar diferentes cinéticas de crecimiento de los precultivos calculando individualmente los volúmenes de precultivo requeridos para la inoculación. Rohe combinó un sistema de manejo de líquidos con un dispositivo biolector pero extendió el sistema mediante la integración de un bastidor de enfriamiento, un lector de placas y una centrífuga de placa de microtitulación. Toda la configuración se incluyó en un gabinete de flujo de aire laminar. El sistema de cultivo automatizado se utilizó para la optimización de la producción secretora de una cutinasa por C. glutamicum. A pesar de que muchos parámetros de proceso se pueden determinar hoy en pequeña escala, la funcionalidad completa para imitar las condiciones del proceso a gran escala, como por ejemplo, la medición del pH en todo el rango, los valores de kLa muy altos (> 1500 h-1) o la alimentación y el control de cualquier sustancia, no se entrega hasta ahora.
Diseño de novedosos microbiorreactores agitados y burbujeados.
En los últimos años, se han desarrollado y publicado diferentes biorreactores miniaturizados en la literatura. Además de los sistemas agitados, como los matraces o las placas de microtitulación, se han investigado otros sistemas, como los sistemas agitados y aireados por burbujas. En varias revisiones y artículos de investigación [2, 5, 7, 69-71] se ofrece una descripción general amplia y completa de los últimos desarrollos. En este capítulo, se presenta un resumen de biorreactores miniaturizados agitados, con burbujas aireadas o agitados con volúmenes <100 ml.
Los sistemas de reactores microbianos agitados tienen algunas ventajas generales. Proporcionan un entorno homogéneo, que ofrece la posibilidad de monitorear de manera integral los parámetros importantes del proceso en línea durante el cultivo. Además, los biorreactores con agitación proporcionan varias opciones para aumentar la mezcla y la transferencia de masa. Según la reproducibilidad de diseño cerrado y la calidad de la medición, los resultados son generalmente altos en sistemas de reactores microbianos agitados. Sin embargo, los microbiorreactores agitados son a menudo costosos y poco adecuados para la experimentación de alto rendimiento. Uno de los primeros biorreactores agitados miniaturizados se informó en 2001. Este microbiorreactor de bajo costo consiste en una cubeta de poliestireno de 4 ml con un volumen de trabajo de 2 ml. Se integraron los optodos para la tensión de oxígeno disuelto (DOT) y las mediciones de pH, una medición de OD y una barra de agitación magnética. Se han alcanzado velocidades de agitación de hasta 300 rpm y valores de kLa de hasta 21 h − 1 en el cultivo de Escherichia coli. En 2003, Lamping publicó un biorreactor de turbina Rushton de 10 ml. El sistema es accionado mecánicamente por un motor eléctrico microfabricado y la aireación se logra con un rociador de tubo único. Por medio de fibra óptica, se realizaron mediciones de DOT, pH y OD. Se alcanzaron valores de kLa hasta ∼ 360 h−1en el sistema agua-aire, pero, para el cultivo de E. coli, se informan valores de hasta 128 h−1. Este sistema de microbiorreactor se caracterizó luego de manera integral en términos de coeficiente de transferencia volumétrico de oxígeno y tiempo de mezcla en un amplio rango de velocidades del impulsor.
Además, la entrada de potencia se determinó mediante mediciones de entrada de potencia eléctrica. Yang y otros usaron un biorreactor agitado miniaturizado con 12 ml de volumen de llenado para los análisis de flujo metabólico. Se aplicó una interfaz de entrada de membrana de perfluoroalcoxialcano para conectar el biorreactor a un espectrómetro de masas para estudios de trazadores 18O para determinar la actividad respiratoria y los flujos metabólicos durante el cultivo de Corynebacterium glutamicum. También se instaló una sonda de pH para determinar el pH. Puskeiler presentó un sistema de biorreactor de poliestireno agitado y miniaturizado, que permite hasta 48 experimentos paralelos. A un volumen de llenado de 8 ml, se alcanzaron valores de kLa de aproximadamente 1600 h−1a una velocidad de agitación de 2300 rpm. Mediante la integración en un sistema robótico de manejo de fluidos, se realizaron el control del pH, las mediciones de OD y la operación de alimentación por lotes. Más tarde, se integró un sensor DOT en estos sistemas. Betts y Baganz informan sobre un prototipo de un biorreactor de tanque agitado miniaturizado de 18 ml. Equipado con medición DOT y pH, se alcanza un valor de kLa de 480 h−1a 7000 rpm. Klein presentó un sistema a pequeña escala de ocho tubos Hungate paralelos con un volumen de trabajo de 10 ml. El sistema funciona como un quimiostato y permite la monitorización de CO2y la medición DOT. Se alcanzó kLa de 48.5h−1a 2000 rpm.
Si solo se requiere un suministro moderado de oxígeno, una alternativa interesante a los microbiorreactores con agitación son la columna de burbujas o los microbiorreactores agitados. Ambos tipos de biorreactores son técnicamente simples y rentables. Doig desarrolló un reactor de columna de burbujas en miniatura con un volumen de trabajo de 2 ml que alcanzó valores de kLa de 220 h−1. El sistema permite mediciones ópticas de DOT y pH. En 2006, se introdujo el sistema Micro 24 (𝜇24), que es un biorreactor de columna de burbuja miniaturizado agitado basado en una placa de microtitulación con sensor de temperatura DOT y pH óptico integrado y sensor de temperatura de conductor térmico. El control individual de pH, DOT y temperatura en cada pozo es posible. El sistema basado en placa de microtitulación disponible comercialmente con DOT y medición de pH y control de temperatura fue probado por Isett con cultivos de E. coli, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Se alcanzó kLa de 56 h−1a 800 rpm.
Estrés hidromecánico en biorreactores
La entrada de potencia de un biorreactor no se introduce uniformemente en el líquido a granel. En algunos puntos de los biorreactores se produce una entrada de alimentación local más alta, mientras que en otros lugares se observa una entrada de alimentación local reducida. La potencia máxima local de entrada (P / VL) max es un parámetro que indica el nivel de estrés hidromecánico al que están expuestos los microorganismos. En general, el daño celular no es un fenómeno definido con precisión. Incluye la alteración de los tamaños de agregados, la liberación de compuestos intracelulares, la variación de las tasas de respiración específicas, la pérdida de viabilidad, la reducción de la producción de biomasa y, finalmente, los cambios en la composición de la pared celular. Para evitar estos efectos, se debe evaluar la cantidad de estrés hidromecánico en los biorreactores. En particular, si está presente una segunda fase líquida de una fuente de carbono orgánico, como aceite vegetal, alcanos o productos químicos insolubles en agua, se debe conocer el nivel y la distribución espacial del estrés hidromecánico para caracterizar suficientemente un bioproceso. Si bien las bacterias son en general bastante robustas, las células animales o los organismos de crecimiento filamentoso, como los hongos, pueden ser más sensibles al estrés hidromecánico. El nivel de esfuerzo hidromecánico dentro del biorreactor depende de las condiciones de operación prevalecientes, el diseño del biorreactor y las propiedades del líquido, como la viscosidad. La respuesta microbiana al estrés hidromecánico varía, dependiendo de las propiedades celulares particulares, como el tamaño y la rigidez de la pared de las células. Las células animales son generalmente sensibles al estrés hidromecánico debido a su tamaño relativamente grande y la falta de una pared celular protectora. Mientras que los biorreactores agitados muestran una entrada de potencia local relativamente baja, la entrada de potencia local en biorreactores de tanque agitado en la misma entrada de potencia específica es aproximadamente un factor de 10 a 20 más alta en comparación con los matraces de agitación. Cabe señalar que la entrada de potencia promedio (P / VL) ø en biorreactores agitados y agitados en condiciones normales de operación está en un rango similar. En consecuencia, la entrada de potencia se introduce más uniformemente en biorreactores agitados que en biorreactores de tanque agitado. Este hallazgo corresponde a la observación durante los cultivos de células hidromecánicamente sensibles en ambos tipos de reactores, en los que se han observado diferentes morfologías. Además de la entrada de energía local en el líquido a granel generado por el agitador, la explosión de burbujas en la superficie del líquido contribuye en gran medida al estrés hidromecánico de las células de los mamíferos en biorreactores aireados. Si las burbujas explotan en la superficie del líquido, se extraen pequeñas gotas de la superficie y se generan altas densidades de energía. En particular, las células animales sensibles podrían dañarse debido a la explosión de la burbuja.
Este efecto está completamente ausente en matraces de agitación desbalanceados aireados en la superficie donde no se generan burbujas.
La influencia de la aireación en biorreactores de tanque agitado en el estrés hidromecánico de microorganismos se investigó recientemente. Se encontró que la tasa máxima de disipación de energía local se reduce en más del 50% en presencia de aire en comparación con las condiciones sin aire y la entrada de potencia específica igual. El factor de reducción exacto depende de la geometría específica del impulsor Rushton de 6 palas aplicado. Curiosamente, se observa una entrada de potencia máxima similar en un matraz de agitación desbalanceado y desconcertado si se ajusta la misma entrada de potencia específica promedio. Peter et al. presentó una correlación para calcular la tasa máxima de disipación de energía local 𝜀max en matraces de agitación desbalanceados en función del régimen de flujo y las condiciones de operación. Los autores determinaron la transición del régimen de flujo no turbulento a turbulento en matraces de agitación desbalanceados a un número de Reynolds de Re> 60 000. Para comprender mejor el efecto del estrés hidromecánico en los microorganismos y obtener una mejor comparabilidad entre el matraz de agitación y los biorreactores de tanque agitado, se deben realizar más investigaciones en el futuro.
Influencia de las tasas de corte en fermentadores
Una caracterización completa de los parámetros operativos relevantes es obligatoria para un desarrollo y ampliación exitosos del proceso. Un parámetro importante, que podría influir fuertemente en las condiciones de cultivo de los microorganismos, es la velocidad de corte efectiva 𝛾̇eff. La velocidad de corte efectiva influye en la viscosidad aparente y, posteriormente, la mezcla y la transferencia de calor en biorreactores agitados. Mientras que los líquidos de baja viscosidad típicamente muestran un comportamiento de flujo newtoniano, es decir, una viscosidad constante sobre la velocidad de cizallamiento, los caldos de fermentación de viscosidad elevada generalmente muestran un comportamiento de flujo no newtoniano, es decir, cambiando la viscosidad sobre la velocidad de cizallamiento. El riesgo de ajustar las condiciones operativas desfavorables, es decir, las condiciones operativas desfasadas, aumenta si se desconoce la tasa de corte efectiva del caldo de cultivo. Giese investigó sistemáticamente la velocidad de corte efectiva en matraces de agitación para una amplia gama de condiciones de operación. Mediante el uso del análisis dimensional, se obtuvo la siguiente ecuación:
De acuerdo con los hallazgos más recientes para los reactores de tanque agitado, se podría demostrar que la velocidad de corte depende de la entrada de potencia específica y no de la velocidad de agitación o la frecuencia de agitación. Usando la ecuación anterior, la tasa de corte efectiva 𝛾̇effen matraces de agitación se puede calcular en función de la entrada de potencia específica P / VL,el volumen de llenadoVL, el diámetro del matrazd, el diámetro de agitación d0, el índice de comportamiento de flujo m, la índice de consistencia del flujo K, el factor proporcional L y el exponente x. La correlación es válida para matraces de agitación con volúmenes nominales que van desde 50 ml hasta 1000 ml y para condiciones de funcionamiento en fase. Se encontró que los valores de L y x son L = 2.06 y x = −0.331. Estos valores están comprobados para las siguientes condiciones de agitación: VR= 50–1000ml, VL= 10–100ml, d0= 25–100mm, entrada de potencia específica: 0.71–15.1 kW m − 3, índice de consistencia K: 49–23 233 mPa sm, índice de comportamiento de flujo m: 0.107–0.867. Giese reportó que, dependiendo del índice de comportamiento de flujo del caldo, la tasa de corte efectiva en matraces de agitación es al menos 1.55 veces mayor que la de los biorreactores de tanque agitado en comparación con la misma entrada de potencia específica. Este aumento de valor podría llevar a una viscosidad aparente un 50% más baja en matraces de agitación en comparación con los biorreactores de tanque agitado.
Ventilación en Microbiorreactores Agitados
El intercambio de gases entre la fase líquida y la fase gaseosa circundante se determina por dos resistencias de transferencia de masa en biorreactores agitados. Además de la resistencia del área de interfaz gas-líquido, existe la resistencia del cierre estéril en el cuello del biorreactor agitado. La resistencia del cierre estéril está determinada por el área de sección transversal del cuello del matraz, la altura del cierre estéril y las propiedades del material. Los tapones de algodón se utilizan normalmente como cierre estéril en matraces de agitación. La resistencia del tapón puede descuidarse si prevalecen tasas moderadas de transferencia de oxígeno. Sin embargo, para altas tasas de transferencia de oxígeno, por ejemplo, en matraces de agitación desconcertados, la resistencia del tapón de algodón puede convertirse en el paso limitante. En los cultivos aeróbicos, también la eliminación de dióxido de carbono de la fase líquida es importante para evitar efectos inhibitorios durante el cultivo. Además, la evaporación del agua debe minimizarse para garantizar condiciones de cultivo uniformes y reproducibles. Se conocen cuatro métodos para determinar experimentalmente la resistencia de los cierres estériles. Además del método dinámico clásico, que determina el aumento de oxígeno en el espacio de cabeza del matraz después del lavado con nitrógeno, Henzler informó sobre un método de estado estacionario que compara diferentes composiciones del espacio de cabeza de los cultivos microbianos en matraces de agitación sellados y no sellados. Otro método se basa en el supuesto de estado estable pero, además, considera la evaporación del agua. Finalmente, se establece un método de bajo costo en el que se mide la pérdida de agua de dos biorreactores agitados equivalentes. Un matraz se llena con agua destilada y el segundo se llena con una solución salina saturada. De las diferentes tasas de evaporación en ambos matraces, se calculan los coeficientes de difusión de oxígeno y dióxido de carbono en el cierre estéril y la humedad relativa en el medio ambiente. Para reducir el esfuerzo experimental, se desarrolló un modelo matemático para determinar la resistencia de los cierres estériles en matraces de agitación. Este modelo permite la predicción de los coeficientes de transferencia de masa de oxígeno de la fase gaseosa en el espacio de cabeza del matraz de agitación. De manera similar a los matraces de agitación, la transferencia de oxígeno a las placas de microtitulación se determina mediante láminas adhesivas de sellado en la parte superior de la placa. Además, la pérdida de agua de los pozos debido a la evaporación desempeña un papel dominante, en comparación con los matraces de agitación, debido a la mayor relación superficie-volumen. Para garantizar un suministro de oxígeno suficiente y al mismo tiempo minimizar la evaporación, debe elegirse un sellado apropiado de la placa de microtitulación. Hasta ahora, no se dispone de una investigación exhaustiva sobre los cierres estériles de placas de microtitulación. Zimmermann y otros investigaron diferentes sellados de membrana disponibles comercialmente. Los autores especifican las propiedades de sellado requeridas y afirman que no existe un producto óptimo que combine una alta permeabilidad al oxígeno y poca evaporación de agua. Duetz desarrolló una tapa especial para placas de 96 pocillos. Consiste en una tapa de acero perforada en la que se coloca una capa de sándwich que consiste en algodón y silicona perforada. Schlepütz y Büchs presentaron una tapa especial para placas de microtitulación de 48 pocillos que reduce la evaporación del etanol durante la producción de vinagre. En el mismo trabajo, se utilizó un modelo de difusión para calcular las dimensiones de un orificio de gasificación en la tapa para garantizar un suministro de oxígeno adecuado durante el cultivo.
Influencia de materiales y viscosidad en biorreactores
Influencia del material del reactor
Los biorreactores agitados disponibles comercialmente tienen diferentes especificaciones técnicas y propiedades. Un parámetro importante es el material del biorreactor. Tiene una fuerte influencia en el rendimiento general del biorreactor. Los parámetros de ingeniería, como el coeficiente de transferencia de masa y los parámetros de funcionamiento, como la frecuencia de agitación más alta aplicable, están influenciados por las propiedades de la superficie de un biorreactor sacudido por agitación. Los matraces de agitación están hechos tradicionalmente de vidrio de borosilicato. Los frascos desechables hechos de policarbonato (PC) o polipropileno (PP) están disponibles comercialmente en la actualidad. Las placas de microtitulación se producen principalmente como desechables y, a menudo, están hechas de poliestireno (PS). También se pueden utilizar otras materias primas, por ejemplo, politetrafluoroetileno (PTFE, Teflon), polipropileno, polimetilmetacrilato (PMMA) o vidrio, para la fabricación de placas de microtitulación. Las propiedades de los materiales varían considerablemente. Las propiedades superficiales pueden ser hidrofílicas o hidrofóbicas. Se pueden usar tratamientos superficiales específicos para modificar las propiedades de la superficie. Este enfoque se eligió para comparar la transferencia de oxígeno en biorreactores de pequeña escala por agitación. Se encontró que el OTRmaxdisminuye en al menos un 50% en matraces de agitación hidrófobos desbalanceados en comparación con matraces hidrófilos.Esta disminución en los matraces hidrófobos es causada por una formación reducida de la película líquida en la pared del matraz. Por lo tanto, casi no se forma un área de transferencia de masa en la pared del matraz. Un comportamiento similar se observa en las placas de microtitulación. En placas con una superficie de pozo hidrófilo, se pudo observar un aumento del OTRmax en comparación con las placas hidrófobas con las mismas frecuencias de agitación. Sin embargo, la mayor frecuencia de agitación aplicable a la que aún no sale líquido de los pozos se reduce en las placas hidrófilas. Como consecuencia, el OTRmaxtotal que se puede alcanzar en ambos tipos de placas es aproximadamente el mismo. Además de las propiedades superficiales del recipiente agitado, la propia propiedad del líquido influye en la característica de humectación de la pared del recipiente. Doig y otros han verificado este efecto para diferentes combinaciones de material / líquido. Se encontró un aumento de hasta el doble del área de transferencia de masa total si se usaba un líquido con tensión superficial reducida.
Influencia de la viscosidad.
La caracterización de la transferencia de masa en biorreactores agitados en la literatura se basa comúnmente en el supuesto de líquidos de viscosidades similares al agua. Las correlaciones publicadas sobre el coeficiente de transferencia de masa volumétrica kLay la capacidad máxima de transferencia de oxígeno OTRmaxno se pueden aplicar para líquidos de viscosidades elevadas. Sin embargo, en los procesos biotecnológicos, la viscosidad de los caldos de cultivo puede aumentar debido a la formación de productos específicos, como, por ejemplo, alginato, ácido 𝛾-poliglutámico o xantano. Las viscosidades elevadas de hasta 110 mPa sen matraces de agitación se reportan en la literatura disponible. Para mejorar el rendimiento de la mezcla y la transferencia de oxígeno en biorreactores agitados a viscosidades elevadas, se pueden introducir deflectores. Sin embargo, los baffles aumentan el riesgo de trabajar en condiciones de operación fuera de fase. En consecuencia, una configuración de biorreactor adecuada debe seleccionarse cuidadosamente. En matraces de agitación desbalanceados, se pudo observar un aumento contra intuitivo del OTRmaxpara líquidos de viscosidades elevadas de hasta 10 mPa s. Este aumento de OTRmaxse explica por un aumento del espesor de la película en la pared del matraz a viscosidades elevadas. El aumento del espesor de la película eleva el gradiente de concentración de conducción de la difusión de oxígeno en la película líquida. Se muestra que el OTRmaxy el gradiente de concentración de conducción más alto se alcanzan a viscosidades de10 mPa s. A viscosidades aún más altas (> 20 mPa s), el OTRmaxdisminuye nuevamente debido a una reducida difusividad de oxígeno en el líquido. Sin embargo, Giese demostró para viscosidades de hasta 80 mPa s que OTRmax no socava los valores iniciales de OTRmaxde viscosidad similar al agua (1 mPa s) nuevamente. En contraste, en los biorreactores de tanque agitado, se observa una disminución del OTRmaxde hasta el 95% del valor inicial de OTRmaxa viscosidades similares al agua a una viscosidad de 80 mPas. Esta fuerte disminución del OTRmaxse explica por una reducción del área de transferencia de masa debido a una reducción de la burbuja y una mayor coalescencia de las burbujas de gas en biorreactores aireados por burbujas. Además, el coeficiente de difusión disminuye al aumentar la viscosidad. En los biorreactores agitados, la potencia de entrada y, por lo tanto, el coeficiente de transferencia de masa kL aumenta al aumentar la viscosidad (en condiciones de operación en fase). El aumento del valor kLcompensa la reducción del coeficiente de difusión. Como consecuencia, la transferencia de oxígeno en biorreactores agitados se reduce solo ligeramente a viscosidades elevadas.
Continuación – Transferencia de masa Gas-líquido
La última ecuación de nuestro post anterior, kLa es una función del volumen de llenado VL, la frecuencia de agitación n, el diámetro de agitación d0y el diámetro del matraz d. Los valores dekLacalculados muestran una precisión de ± 30%en comparación con los resultados experimentales, que se encuentran en el mismo rango de precisión que las correlaciones de transferencia de masa para biorreactores de tanque agitado. Para las placas de microtitulación, se encontró una correlación adimensional para predecir los valores de kLa:
donde Des el coeficiente de difusión de las especies de difusión en un medio, aiel área de superficie específica inicial, Re el número de Reynolds, Sc el número de Schmidt (relación entre la difusividad del momento (viscosidad) y la difusividad de la masa), Fr el número de Froude (la relación entre fuerzas inerciales y gravitacionales), y Bo el número de enlace (relación entre las fuerzas gravitacionales y de superficie). En la ecuación se consideran tanto las fuerzas de inercia axial (debido a la agitación) como las fuerzas de superficie (debido a las propiedades del líquido). (Ecuación anterior) por el número de Froude y Bond. Los exponentes x y y en la ecuación anterior depende de la geometría de la placa de microtitulació. Valores calculados a partir de la ecuación se han correlacionado con los valores de kLamedidos de los cultivos de Bacillus subtilis en medio mineral y concuerdan dentro de ± 30%. Además, los resultados se compararon con los valores de kLamedidos de Hermann. Que también concuerdan bien.
Si se considera la distribución del líquido en las placas de microtitulación, se debe tener en cuenta la tensión superficial del líquido. En tamaños de vasos pequeños, la tensión de la superficie del líquido dificulta la rotación del líquido. Deutz indica que se puede observar la influencia de la tensión superficial de las soluciones acuosas para tamaños de vasos pequeños con un diámetro de pozo <12 mm. Para diámetros de pozo de <4 mm, casi no se observó movimiento de líquido a una frecuencia de agitación de 300 rpm y un diámetro de agitación de 50 mm. Si la tensión superficial no es despreciable, se debe exceder una frecuencia de agitación crítica ncritpara iniciar la rotación del líquido dentro del recipiente. Esta frecuencia de agitación crítica se puede calcular de la siguiente manera:
donde 𝜎es la tensión superficial del líquido, d el diámetro del pozo, VLel volumen de llenado, 𝜌Lla densidad del líquido yd0el diámetro de agitación. Si se excede ncrit, la capacidad máxima de transferencia de oxígeno OTRmaxaumenta al aumentar la frecuencia de agitación. En las frecuencias de agitación por debajo de ncrit, el OTRmaxes independiente de la frecuencia de agitación y alcanza valores al nivel de la transferencia de oxígeno difusivo al líquido estancado no agitado. La tensión superficial 𝜎en la ecuación previa. Depende de las propiedades del líquido. Durante el cultivo, la tensión superficial del líquido se reduce por fragmentos de membrana celular, proteínas, biosurfactantes o glicolípidos extracelulares.
Además de elegir las condiciones de operación apropiadas y las propiedades de la superficie del biorreactor, la integración de deflectores dentro del microbiorreactor representa una alternativa adicional para aumentar la transferencia de oxígeno en biorreactores sacudidos. Incluso si la reproducibilidad de la transferencia de oxígeno entre biorreactores desconcertados individuales es pobre, los deflectores son útiles si la transferencia de oxígeno alta es obligatoria. Funke y otros investigadores informaron un aumento de cinco a diez veces del OTRmax en las placas de microtitulación desconcertadas. Sobre la base de estos datos experimentales, Lattermann publicó una correlación empírica para calcular las capacidades máximas de transferencia de oxígeno en placas de microtitulación de 48 pocillos desconcertados. En esta correlación, el perímetro relativo del pozo Peri se introdujo como parámetro clave. La transferencia de oxígeno se puede calcular en función del perímetro relativo Peri, la frecuencia de agitación n y el volumen de llenado VL:
En esta ecuación es válido para perímetros relativos <1.1. La aplicabilidad de la ecuación para otros sistemas de biorreactores agitados, como un matraz de agitación, todavía tiene que verificarse. Para calcular el área de transferencia de masa a biorreactores desconcertados, los modelos descritos anteriormente de Büchs y Klöckner no se puede aplicar. Debido a la caótica distribución de líquido indefinida, se deben aplicar simulaciones de CDF para determinar la superficie del líquido en biorreactores agitados desconcertados. Recientemente, Li realizó un análisis de CFD para calcular las áreas de transferencia de masa en matraces de agitación desconcertados para líquidos de viscosidades similares al agua.
Las correlaciones kLaempíricas en las ecuaciones consideran experimentos con diferentes propiedades líquidas, por ejemplo, el sistema químico de sulfito y los caldos de cultivo. Por lo tanto, los valores de kLareportados no pueden compararse directamente entre sí. En general, los valores de OTRmaxdeterminados experimentalmente dependen de la solubilidad del oxígeno en el líquido LO2y del coeficiente de difusión de oxígeno D en el líquido. Como consecuencia, los valores de kLaque se han obtenido para un líquido específico deben corregirse con un factor de corrección si se aplican otros líquidos.
Transferencia de masa Gas-líquido
La transferencia de oxígeno en matraces de agitación y placas de microtitulación se investigó ampliamente en los últimos años. La transferencia de masa gas-líquido desempeña un papel importante en muchos cultivos microbianos. El suministro de productos gaseosos, así como la eliminación de productos gaseosos y volátiles es esencial para una fermentación exitosa. En particular, el suministro suficiente de oxígeno en los cultivos aeróbicos puede llegar a ser crítico. La respuesta microbiana a las condiciones de cultivo limitadas de oxígeno varía. Dependiendo de la cepa aplicada, puede ocurrir una desaceleración de la actividad metabólica, la formación de subproductos, o incluso la muerte del cultivo microbiano. Como consecuencia, la selección en microbiorreactores en condiciones de cultivo limitadas de oxígeno probablemente dará como resultado una clasificación distorsionada de las cepas investigadas.
La discrepancia entre la baja solubilidad del oxígeno en los caldos de cultivo y la alta demanda de oxígeno en los cultivos aeróbicos a menudo es una tarea difícil de superar en el proceso y el diseño del biorreactor. La solubilidad del oxígeno en solución salina y en medios de cultivo está en el rango de 1 a 10 mg l − 1. En los microbiorreactores agitados con superficie aireada, como matraces o placas de microtitulación, el suministro de oxígeno no puede mejorarse fácilmente aumentando la velocidad de aireación. El suministro de oxígeno debe ajustarse eligiendo los parámetros de operación apropiados. La capacidad máxima de transferencia de oxígeno en biorreactores agitados aumenta al aumentar la frecuencia de agitación y el diámetro de agitación y al disminuir el volumen de llenado y el diámetro del recipiente (solo si V L1/3/ d = constante). Además, las propiedades de la superficie interna del recipiente, así como las propiedades del líquido (viscosidad, solubilidad del oxígeno y difusividad) influyen considerablemente en la transferencia de oxígeno.
En microbiorreactores agitados, la transferencia de oxígeno se puede caracterizar mediante el uso del sistema químico de sulfito. Este sistema de modelo químico no requiere ningún manejo estéril, es relativamente simple de aplicar y se utiliza para determinar la capacidad máxima de transferencia de oxígeno OTRmaxo el coeficiente de transferencia de masa volumétrica kLa. Además, el área de la superficie del líquido volumétrico “a” se puede determinar si la concentración del catalizador aumenta. En tales casos, el régimen de reacción de la oxidación de sulfito debe estar en el régimen mejorado (Ha> 3). Linek señaló correctamente que el método de oxidación con sulfito puede llevar a resultados incorrectos si el líquido no se mezcla lo suficiente. En ese caso, puede ocurrir una caída de la concentración local de sulfito cerca de la superficie del líquido, causada por el transporte insuficiente de iones de sulfito desde el líquido interno a granel a su superficie. Otro efecto que podría llegar a ser crítico es el cambio de la reacción cinética al final de la oxidación del sulfito. Si la concentración de sulfito cae por debajo de un valor crítico de aproximadamente 0.2 M, la reacción cinética se desacelera. Para evitar este efecto y asegurar una determinación correcta del área de la superficie volumétrica a, el tiempo de la reacción de oxidación del sulfito debe limitarse a las condiciones antes de que el pH caiga bruscamente.
En los últimos años, muchos trabajos de investigación se centraron en las mediciones de transferencia de masa de gas-líquido y transferencia de oxígeno en biorreactores. Dos excelentes revisiones resumen aspectos importantes de la transferencia de masa y las técnicas establecidas para las mediciones de transferencia de oxígeno. La tasa de transferencia de oxígeno (OTR) y el coeficiente de transferencia de masa volumétrica kLa se correlacionan mediante la siguiente ecuación:
La ecuación resulta de un balance de masa de oxígeno alrededor de la fase de gas. En la ecuación c∗O2representa la concentración de oxígeno en el líquido en el límite de la fase, cO2,L la concentración de oxígeno en el líquido a granel, kLacoeficiente volumétrico de transferencia de masa, LO2 la solubilidad del oxígeno en el líquido, soporta la presión absoluta, y∗O2 la fracción molar de O2en el líquido en el límite de la fase yO2,L la fracción molar de O2 en el líquido a granel. La ecuación se puede utilizar para calcular el coeficiente de transferencia de masa volumétrica OTR o kLaen microbiorreactores agitados.
Suponiendo una concentración de oxígeno en la fase líquida cercana a cero (cO2,L ≈0), la transferencia de oxígeno llega a ser máxima (OTR = OTRmax). En los biorreactores agitados, con aireación de superficie, la transferencia de oxígeno al líquido en masa se produce por difusión del oxígeno a través del área de la superficie del líquido. En consecuencia, el área de transferencia de masa de oxígeno, es decir, el área de superficie total del líquido, tiene una influencia distinta en la transferencia de oxígeno al líquido. El área de superficie del líquido total está compuesta por el área de superficie del líquido a granel y la superficie de la película líquida en la pared del reactor y en la parte inferior del biorreactor, lo que contribuye en gran medida a la transferencia de masa total. Debido a la rotación del líquido a granel dentro del recipiente, la película líquida se renueva periódicamente. Büchs desarrolló un modelo para calcular numéricamente la distribución de líquidos y las áreas de superficie en matraces de agitación desbalanceados. La distribución del líquido está influenciada por la frecuencia de agitación, la geometría del matraz, el diámetro de agitación y el volumen de llenado. El modelo solo es válido para viscosidades similares al agua y si no es necesario considerar la tensión superficial. Los resultados de este modelo se han comparado visualmente con fotografías de líquidos giratorios dentro de matraces de agitación. Las alturas máximas de líquido calculadas coincidieron dentro de ± 15% con los valores experimentales. Klöckner extendió este modelo para biorreactores cilíndricos sacudidos más grandes e incluyó un cálculo de la entrada de potencia específica. En este modelo extendido, solo se pueden aplicar geometrías con un diámetro de recipiente mayor que el diámetro de agitación. Los resultados de la simulación concuerdan bien con los cálculos de CFD para la superficie del líquido, así como con los datos experimentales para el área de transferencia de masa total y la entrada de potencia específica.
Como se describió anteriormente, el OTRmaxde un biorreactor agitado se puede determinar experimentalmente utilizando el sistema químico de sulfito. Además del cálculo del coeficiente de transferencia de masa volumétrica kLa, en la literatura se reportan varias ecuaciones empíricas para determinar los valores de kLaen biorreactores. Estas correlaciones son difíciles de comparar entre sí porque los métodos de medición aplicados varían. Para matraces de agitación desbalanceados, Seletzky desarrolló una correlación empírica para calcular la transferencia de masa volumétrica del sistema químico de sulfito:
Fenómenos desfasados en biorreactores
En los biorreactores agitados, el movimiento de agitación de la mesa de agitación conduce a una rotación del líquido a granel dentro del recipiente agitado. En condiciones de agitación adecuadas, el líquido a granel presenta una forma característica y sigue el movimiento circular de la mesa de agitación. El líquido a granel está orientado en la dirección de la fuerza centrífuga Fcy gira alrededor del radio interior ria lo largo de la pared del reactor con una velocidad angular 𝜔. Estas condiciones de funcionamiento distintas designan la llamada condición de operación en fase. En ese caso, la forma del líquido está bien definida, y el área de contacto de la pared AW y el área interfacial de gas / líquido AS se pueden calcular con precisión. Además, se forma una película líquida en la pared y el fondo del reactor, que no está cubierta por el líquido a granel. Esta película líquida contribuye en gran medida a la transferencia de masa de gas / líquido en biorreactores agitados. La forma del líquido depende de la geometría del recipiente, los parámetros de agitación dados y solo un poco de las propiedades fisicoquímicas del líquido.
En condiciones de agitación inadecuadas, el líquido no presenta una forma bien definida ni sigue el movimiento de rotación del agitador. De hecho, una gran parte del líquido se adhiere al fondo del recipiente y no muestra ningún movimiento relativo al matraz. Como resultado, la potencia de entrada, así como la transferencia de masa y la mezcla se reducen considerablemente y el rendimiento y la reproducibilidad generales del reactor disminuyen. Esta condición de operación se identifica como condición de operación fuera de fase. La viscosidad elevada promueve condiciones fuera de fase. Como consecuencia, la selección de microorganismos en condiciones fuera de fase posiblemente resultará en la selección de mutantes morfológicos y condiciones de cultivo de baja viscosidad debido a la presión de selección aplicada. En estas condiciones, es poco probable que se identifiquen las cepas con un rendimiento óptimo. Por lo tanto, deben evitarse las condiciones fuera de fase para el cribado y otros experimentos de cultivo. La probabilidad de trabajar en condiciones fuera de fase aumenta si se utilizan biorreactores sacudidos desconcertados. Para determinar las condiciones fuera de fase en matraces de agitación desbalanceados, Büchs et al. desarrolló una ecuación basada en el número de fase no dimensional Ph:
a) 
Con el número de la película Reynolds Ref:
b) 
La primera ecuación solo es válida para un número de Froude axial Framayor que 0.4:
c) 
Cabe mencionar que el fenómeno fuera de fase solo ocurre con una viscosidad elevada, por ejemplo, con el crecimiento filamentoso de microorganismos o la producción de biopolímeros si las condiciones típicas de agitación para matraces (d0= 25–50 mm, VL<1 l) se aplican. Las ecuaciones se derivan de la adaptación del comportamiento del fluido en un tambor giratorio parcialmente lleno para agitar los matraces. Teniendo en cuenta este fondo mecánico, la aparición de condiciones fuera de fase en otros sistemas de biorreactores con agitación, por ejemplo, placas de microtitulación, se puede estimar aproximadamente con las ecuaciones anteriores.
Mezcla en microbiorreactores
Los tiempos de mezcla en los biorreactores dependen directamente de la entrada de potencia específica introducida en el biorreactor. En consecuencia, el número de fase Ph dado en la ec. (a) influye directamente en el tiempo de mezcla en biorreactores sacudidos. Además de la geometría del recipiente agitado y el volumen de llenado VL, las propiedades del líquido, como la densidad del líquido 𝜌la viscosidad 𝜂, influyen en el número de fase. La viscosidad del líquido 𝜂es de especial interés para los tiempos de mezcla porque puede cambiar durante el cultivo de, por ejemplo, un hongo filamentoso, si todos los demás parámetros del proceso se mantienen constantes. Para determinar los tiempos de mezcla experimentalmente, se pueden aplicar diferentes métodos. Los métodos simples de fácil ejecución y técnicos son la medición de la temperatura, la conductividad y el pH, así como los métodos colorimétricos. Los métodos técnicos más desafiantes representan la medición del índice de refracción, la fluorescencia y la radioactividad. Tan et al. determinnó tiempos de mezcla de ácido sulfúrico 2 My 10 M(viscosidades de 1 mPa sy 5 mPa s, respectivamente) en agua desionizada en experimentos en matraz de agitación con frecuencia de agitación, tamaño variable del matraz y diámetro de agitación (n = 100) –350 rpm, VR = 100–500ml, d0 = 25–50mm, 10% de volumen de llenado relativo). Los autores reportan valores entre 1 y 10 s. Barrett et al. determinaron los tiempos de mezcla en placas de microtitulación de 24 pocillos. Para los números de Reynolds Re> 1830, se informan los tiempos de mezcla medios de 1.7 s para 800 μl y 1000 μl de volumen de llenado. Zhang et al. utilizaron análisis de CFD para investigar la mezcla en placas de microtitulación. Muestran que la intensidad de la mezcla, es decir, la fuerza de la mezcla de una o más fases, es mayor en las placas de microtitulación de 96 pocillos en comparación con las placas de 24 pocillos debido a la aparición de un componente axial de la velocidad del fluido durante la agitación.