Monitoreo del estrés y cambios fisiológicos y la carga metabólica
El seguimiento de los cambios fisiológicos de los procesos de producción de proteínas recombinantes es la clave para la comprensión de los procesos y sistemas y, por lo tanto, la clave para el diseño y la optimización racionales de los bioprocesos en biorreactores con tanques de acero inoxidable.
La caracterización del impacto metabólico durante los procesos de producción de proteínas recombinantes a menudo se puede realizar mediante la estimación de parámetros y cambios fisiológicos clásicos, como los rendimientos de crecimiento, las tasas de crecimiento específicas máximas, así como el consumo específico de sustrato o las tasas de producción específicas de subproductos.
Estos indicadores se basan en la medición de variables como la concentración de biomasa, el consumo de oxígeno y las tasas de producción de CO2 o la concentración de sustratos y subproductos.
No obstante, estos parámetros no revelan la extensión y los aspectos mecanicistas de los cambios fisiológicos subyacentes.
Además del monitoreo estándar de variables físicas y químicas, una serie de técnicas fuera de línea y dispositivos de monitoreo de procesos en línea permiten estimar y medir parámetros y cambios fisiológicos como la viabilidad celular, producto recombinante, así como metabolitos indicadores u otros componentes celulares que responden a la adaptación fisiológica de las células a la expresión de proteínas recombinantes.
Además, la transcriptómica, la proteómica, la metabolómica y la fluxómica también se están utilizando como una herramienta para la comprensión a nivel del sistema de la respuesta celular y la adaptación a la producción de proteínas recombinantes, tanto como base de conocimientos para la mejora racional de la cepa (ingeniería metabólica) como para la identificación del estrés. genes informadores adecuados para la optimización de bioprocesos.
La producción de proteínas recombinantes lleva a las células a estados de estrés y puede conducir a la muerte celular durante el proceso de producción.
La citometría de flujo se ha utilizado ampliamente para determinar la fracción de células muertas mediante tinción diferencial de células con yodo de propidio, desde bacterias y levaduras hasta células de mamíferos.
Mediante la tinción triple con fluorocromo con yoduro de propidio, bromuro de etidio y bisoxonol, es posible discriminar entre células no dañadas, dañadas (membrana despolarizada) y muertas.
La citometría de flujo con una variedad de marcadores fluorescentes también se ha utilizado para estudiar la progresión del ciclo celular y los eventos de muerte celular programada (apoptosis) durante los cultivos de células de mamíferos en biorreactores, que ha demostrado ser una herramienta valiosa para la optimización de estrategias de cultivo y tecnologías analíticas de procesos.
Esta técnica también se puede aplicar para medir una amplia variedad de rasgos metabólicos complejos, por ejemplo, la detección de la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y condiciones redox in vivo.
El plegamiento y la secreción de proteínas oxidativas pueden sobrecargar la capacidad redox del retículo endoplásmico (RE), lo que resulta en la acumulación de ROS y proteínas mal plegadas / desplegadas en este compartimento.
La tinción de ROS se puede lograr típicamente usando diferentes sondas fluorescentes como DHE (dihidroetidio), DHR (dihidrorrodamina 123) y DCF (2 ′, 7′-diclorodidrofluoresceína), mientras que un estudio reciente ha demostrado que las condiciones redox in vivo en el RE y el citosol de las células de levadura puede controlarse dirigiendo variantes de GFP sensibles a redox (roGFP) a los respectivos orgánulos.
El último procedimiento es un ejemplo de un biosensor codificado genéticamente, que no requiere la adición de sustancias químicas exógenas.
Dichos biosensores también pueden diseñarse de tal manera que la expresión de la proteína fluorescente esté bajo el control transcripcional de un promotor cuya actividad está regulada por la señal intracelular de interés, por ejemplo, promotores sensibles al estrés.
Por ejemplo, la señal de fluorescencia de GFP expresada en E. coli bajo un promotor sensible al estrés se puede medir mediante espectroscopia de fluorescencia de longitud de onda múltiple 2D o citometría de flujo, lo que permite el monitoreo de estrés in vivo en línea o en línea, como una alternativa a la medición directa. de los niveles de ARNm de genes de estrés seleccionados.
Los componentes proteicos de superficie e intracelulares (incluidos los cuerpos de inclusión) también se pueden teñir mediante técnicas de inmunofluorescencia para el análisis de citometría de flujo posterior. Para acceder a los objetivos intracelulares, las células se permeabilizan suavemente.
Se han utilizado procedimientos de inmunotinción intracelular para monitorizar y cuantificar la formación de cuerpos de inclusión en E. coli o el producto recombinante retenido en las células y los marcadores UPR como la proteína BiP en levadura.
BiP es un acompañante de la clase HSP70 que juega un papel importante en la respuesta al estrés de las proteínas desplegadas.
De lo contrario, las proteínas de fusión GFP y GFP se pueden usar para correlacionar la fisiología de una sola célula y la población con los niveles de expresión de proteínas recombinantes, lo que proporciona una herramienta valiosa para optimizar las estrategias de cultivo / inducción.
Cabe destacar que la citometría de flujo es compatible con la implementación de análisis multiparamétricos (multiplexados), mejorando la discriminación de estados y cambios fisiológicos, además de proporcionar información valiosa sobre la heterogeneidad fenotípica de una población microbiana.
Además, estos procedimientos pueden automatizarse potencialmente conectando un citómetro de flujo directamente a un biorreactor, ofreciendo una herramienta muy poderosa para monitorear las propiedades fisiológicas de las células microbianas y de mamíferos en condiciones relacionadas con el proceso.
Expresión de alto nivel de proteínas recombinantes
Se ha reconocido y documentado desde hace mucho tiempo que la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes heterólogas tiene un impacto directo en el metabolismo del huésped, a menudo afectando negativamente los parámetros de crecimiento como la tasa de crecimiento, el rendimiento de biomasa y la tasa de consumo de sustrato específico, por ejemplo, en bacterias, levaduras, y células de mamíferos.
Estos obstáculos son responsables de limitar la cantidad de proteína extraña que se puede producir a partir del organismo.
Por un lado, la expresión de genes extraños conduce a un aumento en la transcripción y traducción específicas, que puede llegar a ser limitante a niveles muy altos debido al agotamiento de precursores y energía, como se describe para E. coli.
Además, se ha descrito una carga metabólica relacionada con el mantenimiento del plásmido.
Además, E. coli provoca una respuesta al estrés como resultado de la sobreexpresión de proteínas recombinantes que desencadena la regulación positiva de los genes del estrés, incluidos los genes de choque térmico, chaperona y que codifican proteasas.
En este caso, se ha demostrado que la formación de agregados de productos (cuerpos de inclusión) y productos mal plegados, como resultado de altas tasas de síntesis, es un factor importante.
No obstante, el perfil transcripcional de las respuestas al estrés a la expresión de alto nivel de proteínas en cultivos de alta densidad celular es diferente al de los cultivos de baja densidad celular.
También se ha informado de la carga asociada con la demanda metabólica de síntesis de proteínas recombinantes para la expresión de alto nivel de productos intracelulares en levaduras.
Sin embargo, considerando las productividades específicas moderadas de las proteínas secretadas que a menudo se logran en los sistemas de levadura, las limitaciones en la síntesis, transcripción y traducción de aminoácidos no parecen ser un obstáculo importante.
Aún así, la demanda de energía es significativamente mayor para las proteínas secretadas, ya que el plegamiento, la glicosilación y la secreción son vías que consumen mucha energía.
De hecho, se ha observado una carga metabólica relacionada con la secreción de proteínas en levaduras, incluso a niveles de expresión bajos a medios.
Existe una amplia evidencia de limitaciones en la translocación de la membrana, el procesamiento de la secuencia de señales y el plegamiento dentro del retículo endoplasmático.
Se han descrito respuestas de estrés celular a proteínas desplegadas (respuesta de proteína desplegada, UPR) para levaduras, hongos filamentosos y eucariotas superiores, y se ha demostrado que se desencadenan tras la sobreexpresión de una proteína recombinante secretada, lo que aumenta el metabolismo demanda de los procesos de plegamiento y secreción.
La UPR también está relacionada con la degradación de proteínas a través de la vía de degradación de proteínas asociada a ER (ERAD), un proceso que detecta proteínas mal plegadas y las redirige a la degradación proteasomal en el citosol, actuando como una vía de alivio del estrés.
En este contexto, las mediciones recientes de los flujos intracelulares de proteínas secretadas en levadura utilizando estrategias de marcaje isotópico han revelado que una fracción significativa de la proteína recombinante sintetizada (más del 50%) está realmente degradada.
Además, la UPR regula varios procesos metabólicos como la síntesis de lípidos y aminoácidos, además de regular negativamente la expresión de proteínas secretadas en hongos.
En general, los procesos de plegado, modificación postraduccional y transporte son costosos en términos de energía y bloques de construcción de carbono.
Es importante destacar que la interacción de las tensiones externas (p. Ej., Temperatura, pH, osmolaridad, disponibilidad de oxígeno) y la tensión intrínseca desencadenada por la sobreexpresión de proteínas, en particular por el plegamiento y la secreción, juega un papel importante en las limitaciones fisiológicas de un sistema de producción, que comparten patrones similares entre diferentes clases de fábricas de células.
Limitaciones fisiológicas en cultivos a gran escala
Además, un problema importante en los cultivos microbianos y celulares recombinantes a gran escala es la existencia de condiciones ambientales heterogéneas generadas por biorreactores industriales a gran escala, por ejemplo, temperatura, pH, tensión de oxígeno disuelto o fluctuaciones de concentración de sustrato.
Tales condiciones hidrodinámicas no ideales en biorreactores a gran escala se han estudiado en biorreactores reducidos, que consisten en una parte mixta conectada a una parte no mezclada por una bomba de recirculación, imitando así las condiciones hidrodinámicas encontradas a gran escala.
Se ha demostrado que las condiciones heterogéneas, como los gradientes de sustrato en cultivos en biorreactores a gran escala de E. coli recombinante, reducen el rendimiento celular y aumentan la formación de subproductos, así como la lisis celular, lo que da como resultado la proteólisis del producto.
La concentración de sustrato oscilante y los niveles de oxígeno disuelto condujeron a una disminución de la absorción de glucosa en biorreactores, la formación de etanol y una síntesis de aminoácidos alterada en Bacillus subtilis, mientras que las condiciones limitantes de oxígeno oscilante disminuyeron la tasa de crecimiento específico y aumentaron la formación de subproductos en Pichia pastoris.
Además, las inhomogeneidades en los biorreactores a escala de producción también pueden afectar la calidad del producto en cultivos de células de mamíferos, donde se ha informado que las condiciones heterogéneas en el oxígeno disuelto afectan la N-glicosilación de varias proteínas recombinantes en cultivos de células de mamíferos.
Proteínas recombinantes y la operación de un biorreactor.
A priori, se pueden considerar tres modos operativos para la producción de proteínas recombinantes, a saber, cultivo discontinuo, discontinuo y continuo en la operación de un biorreactor.
Para la viabilidad económica, cualquier método de cultivo tiene que cumplir con varios criterios, incluyendo alta productividad volumétrica, alta concentración de producto final, estabilidad y reproducibilidad del proceso, sustratos de bajo costo (en el caso de proteínas a granel), así como restricciones legales, para, por ejemplo, los relacionados con la aplicación de tecnología de ADN recombinante.
Los cultivos por lotes generalmente no son adecuados para la producción a gran escala. La alta concentración de sustrato (azúcar) al inicio del cultivo provoca fenómenos de represión de catabolitos. Además, la sensibilidad osmótica de las células (o la toxicidad del sustrato, por ejemplo, cuando se usa metanol como fuente de carbono en sistemas de levadura metilotrófica) impone un límite a la concentración inicial de nutrientes. Además, dado que no se puede controlar la tasa de crecimiento, el cultivo por lotes se ve limitado por el oxígeno en la operación de un biorreactor. Las altas tasas de crecimiento también pueden causar un metabolismo de desbordamiento, lo que lleva a la formación de subproductos, incluso en presencia de oxígeno; por ejemplo, la fermentación alcohólica se desencadena en algunas levaduras como Saccharomyces cerevisiae, la formación de acetato en Escherichia coli o la excreción de lactato y amonio en cultivos de células de mamíferos en la operación de un biorreactor. Además, el agotamiento de los nutrientes y la acumulación de subproductos conducen a la apoptosis (muerte celular programada) en los sistemas celulares de los mamíferos. Por el contrario, la tasa de crecimiento en cultivos continuos y en lotes alimentados se puede modular mediante la adición controlada de sustrato, evitando así la formación de subproductos y los fenómenos de represión de catabolitos enla operación de un biorreactor, además de permitir la adaptación de la absorción de oxígeno y la generación de calor al rendimiento del biorreactor. Sin embargo, los cultivos continuos prolongados pueden dar como resultado la acumulación de poblaciones de células menos productivas o no productivas y, por lo tanto, una disminución de la productividad.
Como resultado, el cultivo por lotes alimentado es a menudo el modo operativo preferido para la producción a gran escala de proteínas heterólogas. En particular, los procesos de alimentación por lotes se realizan típicamente a una tasa de crecimiento baja cuando se operan en condiciones que limitan el sustrato. Por lo tanto, los efectos de una tasa de crecimiento bajan sobre la fisiología celular y las tasas de formación de productos de las células son de importancia clave y tienen un gran impacto en la productividad específica. Por ejemplo, se pueden provocar respuestas celulares como la falta de nutrientes, contribuyendo así al estrés metabólico de las células huésped. Estudios transcriptómicos recientes en levaduras han revelado que la tasa de crecimiento regula procesos centrales como la síntesis y secreción de proteínas, así como la respuesta al estrés. En particular, una parte sustancial del carbono del sustrato se gasta para satisfacer los requisitos de energía de mantenimiento en condiciones que limitan el crecimiento, como las que se encuentran en los procesos de alimentación por lotes. Los altos requisitos de mantenimiento van a expensas de la biomasa y la formación de productos y, por lo tanto, no son deseables en la producción de proteínas heterólogas. Los requisitos de mantenimiento pueden verse significativamente influenciados por parámetros ambientales como la temperatura, el pH y la composición del medio.
Además, los procesos de producción de proteínas recombinantes se llevan a cabo normalmente en cultivos de alta densidad celular (HCDC) para maximizar los rendimientos espacio-temporales y las productividades volumétricas. En HCDC, las células a menudo sufren varios desafíos fisiológicos, incluida la disponibilidad limitada de oxígeno, la acumulación de dióxido de carbono a niveles que pueden disminuir la tasa de crecimiento y estimular la formación de subproductos (por ejemplo, acetato en E. coli), la generación de calor y la eficiencia de mezcla reducida. Tales tensiones ambientales en HCDC de lotes alimentados no ocurren simplemente como respuestas transitorias a cambios repentinos (choque), sino más bien como una adaptación a largo plazo de las células productoras a condiciones subóptimas. De hecho, las células están expuestas a una limitación de energía progresivamente creciente, experimentando una mayor muerte y lisis celular, segregación en estados viables, pero no cultivables y perfiles transcripcionales alterados a altas densidades celulares. Por lo tanto, la inducción de la expresión de proteínas recombinantes bajo estas condiciones de estrés «basal» impone un estrés intrínseco adicional superpuesto al sistema.
Una complicación adicional en huéspedes procarióticos como E. coli son los mecanismos de detección de quórum, es decir, los sistemas de señalización intercelular reguladores del crecimiento en los que una molécula de señal extracelular soluble que, al alcanzar una concentración crítica en el medio, permite la activación sincrónica de la respuesta a nivel de población, por ejemplo, en respuesta a un estrés ambiental o limitación de nutrientes. DeLisa y col. demostraron que E. coli comunica el estrés o la carga impuesta por la acumulación de proteína heteróloga. Se han descrito varios mecanismos similares a la detección de quórum en levaduras. Sin embargo, aún se desconoce cómo estos mecanismos pueden interferir con la producción de proteínas en estos microorganismos.
Biorreactores continuos para cultivo de células madre atrapadas
Cuando las células madre atrapadas se cultivan en sistemas discontinuos, la fuerza impulsora para la entrada de nutrientes y la salida de metabolitos en la construcción de material que contiene las células madre disminuye continuamente. En sistemas continuos con retención de células, esta fuerza impulsora se puede mantener casi constante. Hay dos tipos generales de biorreactores que se pueden utilizar en una operación continua: mezclados “perfectamente” y de flujo pistón. Un ejemplo de un biorreactor perfectamente mezclado es un reactor de tanque agitado continuo (CSTR) con un mecanismo de retención de células, mientras que una configuración de reactor de flujo de pistón (PFR) correspondería a una construcción que contiene células, que es parte de un fluido circuito que fluye a través del material poroso que contiene las células. La configuración PFR permite que el medio fresco sea forzado dentro de la estructura porosa del andamio, creando así un flujo convectivo, que minimiza las distancias de difusión mientras se mantiene por debajo de los valores críticos de velocidad de corte. Además, este tipo de flujo es muy eficaz para sembrar las células en los andamios al comienzo del cultivo de células madre atrapadas. El trabajo de Wendt estableció una comparación entre matraces giratorios de placas de pocillos (estáticos) (agitados) y una siembra de células de condrocitos PFR (perfundida). Estos autores demostraron que el sistema PFR permitió una siembra celular significativamente más uniforme y eficiente. También se demostró que las células del estroma de la médula ósea se distribuyen de manera más uniforme en armazones cerámicos cuando se utiliza la siembra perfundida, en comparación con el control estático. Es importante recordar que las construcciones que pueden ser perfundidas por PFR son porosas, es decir, este sistema de cultivo no es apropiado para andamios de hidrogel, que tienen una permeabilidad hidráulica menor.
El principal inconveniente de los reactores PFR es la dificultad para medir y controlar el pH y el OD dentro del andamio; además, es muy difícil medir el crecimiento celular, lo que hace que la optimización de estos procesos sea mayoritariamente empírica. Estos problemas pueden minimizarse teniendo tiempos de residencia bajos (1 – 10 s) del medio de cultivo en el armazón y monitoreando los parámetros en la salida mientras se aplica el control en la entrada. El requisito de tener tiempos de residencia bajos en el PFR implica que la longitud de la construcción perfundida por el medio de cultivo se mantiene dentro de la escala milimétrica, lo que hace que el sistema sea difícil de escalar. La mayoría de los sistemas PFR utilizados en cultivos de células madre atrapadas tienen una recirculación media en un depósito, lo que aumenta el tiempo de residencia general de todo el sistema a varios días, es decir, cerca de los niveles de CSTR. Por lo tanto, mientras que la transferencia de masa en la construcción es convectiva, el medio de cultivo total utilizado se mantiene al mismo costo que un CSTR. En general, los sistemas PFR no se pueden ampliar a escala, pero proporcionan las condiciones adecuadas para sembrar y cultivar células madre atrapadas para un producto terapéutico autólogo. De hecho, la falta de sensores en cualquier sistema de procesamiento cerrado simplifica el problema regulatorio ya que para cada sensor hay un modo de falla asociado, o riesgo, que necesita ser mitigado. Por estas razones, la principal aplicación terapéutica de este reactor continuo ha sido la ingeniería de tejido óseo autólogo.
Los reactores continuos de tanque agitado, a diferencia de los PFR, tienen tiempos de residencia más altos (1 a 4 días) y la transferencia de masa dentro del material es difusional, lo que limita el tamaño de los andamios a cientos de micrómetros para minimizar el dC ∕ gradientes. Por el contrario, es posible tomar muestras del caldo de cultivo y así medir el crecimiento celular y la composición del medio de cultivo. La medición y el control de pH y OD se realizan en el caldo de cultivo que se mezcla homogéneamente, es decir, se conoce el OD y el pH en las proximidades del armazón. Otra ventaja del CSTR en comparación con los PFR es su escalabilidad. Al considerar las terapias celulares alogénicas, donde la escalabilidad permite el establecimiento de economías de escala, un CSTR tiende a ser la opción más apropiada para obtener un gran número de células bajo un sistema controlado. El grupo Zandstra de la Universidad de Toronto ha demostrado que un CSTR evita la fluctuación de la composición del medio de cultivo entre intercambios de medio discretos en la expansión de mESC encapsulada en alginato; Una ventaja que a menudo se pasa por alto de los sistemas continuos sobre los intercambios de medios discretos es que evita las tensiones del proceso, como interrumpir la agitación, para permitir que las construcciones se asienten antes de reemplazar el medio.
Uno de los aspectos más difíciles al comparar el rendimiento de diferentes configuraciones de reactores es el acoplamiento entre la transferencia de masa y el tiempo de residencia. En un PFR, la transferencia de masa y el tiempo de residencia están acoplados porque la tasa de flujo del medio de cultivo (o la velocidad superficial = tasa de flujo ∕ área del andamio) proporciona tanto el intercambio de medios como el transporte de masa convectivo. En un CSTR, la transferencia de masa se desacopla del tiempo de residencia porque la rotación del impulsor proporciona la transferencia de masa, mientras que la tasa de flujo de perfusión proporciona el tiempo de residencia (o tasa de reemplazo media). Teniendo en cuenta este tema, algunos autores han comparado el efecto de los diferentes mecanismos de transferencia de masa en un reactor de tipo PFR, un recipiente de tanque agitado, un recipiente de pared giratoria y un reactor biaxial (BXR) con el mismo tiempo de residencia entre los cuatro reactores para humanos cultivo de MSC fetal en un andamio de policaprolactona-fosfato tricálcico (PCL-TCP). Los resultados mostraron que el BXR produjo más células a una tasa de crecimiento más rápida con más formación de hueso ectópico en ratones inmunodeficientes en comparación con los otros tres tipos de reactores. Curiosamente, los autores también han notado la presencia de «orificios de perfusión» en el reactor PFR, lo que plantea la hipótesis de que el andamio podría degradarse mecánicamente por el flujo de fluido en este tipo de reactor. Se había demostrado anteriormente que el BXR mejora el flujo de fluido dentro de los andamios de 20 a 40 veces, debido a su movimiento bidireccional, mientras mantiene los niveles de esfuerzo cortante por debajo de 2 Pa y es una de las innovaciones más recientes en el campo de los biorreactores continuos.
Muchos de los principios del bioprocesamiento de proteínas recombinantes han sido adoptados por el incipiente campo del bioprocesamiento de células madre; en la producción de proteínas recombinantes, cuando las células se cultivan en un biorreactor continuo con retención celular, cuanto mayor es el flujo, mayor es el crecimiento de las células, ya que el objetivo principal es eliminar los metabolitos y agregar nutrientes al cultivo celular; típicamente, la tasa de flujo de perfusión solo está limitada por las tensiones adicionales del proceso que se originan en el mecanismo de retención celular o la dilución del producto secretado. En el bioprocesamiento de células madre atrapadas, aunque todavía es necesario agregar nutrientes y eliminar metabolitos, también puede ser importante retener factores solubles o proteínas ECM que son producidas por las células que tienen un efecto positivo en el tipo de célula final deseado. Esta idea ha sido demostrada por Junho y Ma mediante la construcción de un sistema de biorreactor donde un andamio poroso de tereftalato de polietileno (PET) sembrado con hMSC se cultivó con medio perfundido a través del andamio o tangencialmente a él, proporcionando así una transferencia de masa por convección o difusión en el interior el andamio, respectivamente. Al comparar estos sistemas entre sí, se encontró que el sistema de perfusión tangencial favorecía la expansión de hMSC indiferenciadas, mientras que el cultivo de perfusión de flujo continuo estaba enriquecido en marcadores osteogénicos como BMP-2, ALP y RUNX2. Los autores han correlacionado aún más este destino celular diferencial con un aumento en las proteínas ECM fibronectina, vitronectina y colágeno tipo I en el flujo tangencial. Por tanto, para diferentes destinos celulares, las limitaciones de difusión de la transferencia de masa pueden ser beneficiosas o perjudiciales.
La agarosa – polisacáridos en el cultivo de células madre
Los polisacáridos en el cultivo de células madre son, al igual que las proteínas, un componente natural de la ECM. La principal ventaja de los polisacáridos sobre las proteínas es que los monómeros de partida son más pequeños y, por tanto, más fáciles de manipular y esterilizar. En su forma no modificada, estos carbohidratos no se unen a las células. En cambio, obligan a las poblaciones celulares a formar contactos célula-célula una vez que estos están contenidos dentro del material.
La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta extraído de algas o algas marinas y está compuesto estructuralmente por los monómeros D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactopiranosa. Históricamente, se ha utilizado para la electroforesis de ácidos nucleicos. Cuando la agarosa se disuelve en una solución acuosa, se puede solubilizar calentando la mezcla; una vez que esta mezcla se enfría a la temperatura de gelificación, se vuelve sólida. Para resolubilizar el gel, es necesario calentarlo a la temperatura de fusión, que es significativamente más alta que la temperatura de gelificación.
Se utilizan geles de agarosa con baja temperatura de gelificación / fusión para hacer que este proceso sea compatible con el atrapamiento celular, y al cambiar la concentración de agarosa en la mezcla final es posible ajustar la rigidez del material.
Se demostró que el cultivo de hMSC en geles de agarosa al 2% (p / v) era tan eficaz como el cultivo de sedimentos estándar de oro para la diferenciación condrogénica de estas células madre. La diferenciación condrogénica de MSC en geles de agarosa al 2% también fue estudiada por Mauck et al .; En este caso, las células quedaron atrapadas en discos de 4 × 1,5 mm (diámetro x espesor) y sometidas a una carga de compresión cíclica, lo que resultó en un aumento en la cantidad de glicosaminoglicanos (GAG) producidos después de 4 semanas, en comparación con un control sin carga. Este último trabajo ejemplifica la importancia de las fuerzas aplicadas a los cultivos de células madre y cómo se pueden utilizar los biomateriales para permitir tales procesos.
Los alginatos son polímeros compuestos por residuos de 𝛽-D-manuronato (M) y 𝛼-L-guluronato (G), que se extraen de las algas pardas. Sus ventajas y proceso de extracción son similares a la agarosa, pero el alginato forma una solución viscosa aniónica que gelifica solo en presencia de cationes divalentes como calcio o bario (los agentes reticulantes). El efecto del alginato en el procesamiento de células madre ha sido estudiado a fondo donde las hESC se cultivaron como esferoides multicelulares 3D o adherentes a microportadores en vasos giratorios. Estas dos configuraciones de cultivo se compararon por su capacidad para expandir hESC indiferenciadas con o sin encapsulación en alginato al 1,1%. Los resultados mostraron que sin la encapsulación de alginato los agregados de hESC no sobrevivieron durante el período de cultivo de 2 semanas. Para las hESC inmovilizadas en microvehículos, la encapsulación de alginato produjo un aumento del 40% en el número final de células.
Los resultados de esta matriz experimental sugieren que, si bien se sabe que el esfuerzo cortante es perjudicial para los cultivos de ESC, el efecto principal de la encapsulación de alginato es la individualización de las “unidades” de cultivo (ya sean agregados o microportadores). En ausencia de encapsulación de alginato, estas unidades se agrupan, lo que conduce a la muerte celular en los agregados y a una proliferación limitada en los microportadores debido a las limitaciones de nutrientes en el núcleo de las unidades agregadas. En otro trabajo, los armazones de agarosa y alginato se compararon con un armazón comercial de gelatina (una forma de colágeno), Surgifoam®, por su capacidad para diferenciar las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hADSC) en cartílago. Las células tendieron a adherirse y extenderse en el armazón de gelatina, adoptando una configuración alargada, mientras que en el armazón de agarosa y alginato las células permanecieron redondeadas y solo interactuaron entre ellas.
Las células tendieron a adherirse y extenderse en el armazón de gelatina, adoptando una configuración alargada, mientras que en el armazón de agarosa y alginato las células permanecieron redondeadas y solo interactuaron entre ellas. Esto condujo a diferencias significativas en el tipo de cartílago obtenido al usar gelatina en comparación con los materiales derivados de las algas. Estos resultados se pueden generalizar para resaltar la diferencia entre los materiales bioactivos que interactúan físicamente con las células madre y los materiales para los procesos en biorreactores que son biológicamente inertes, como es el caso de la agarosa (no modificada) y el alginato.El hialurano (o ácido hialurónico, HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado, ubicuo en toda la ECM y similar al colágeno, tiene una baja reactividad inmunológica y es biodegradable. Está constituido por monómeros de N -acetilglucosamina y ácido glucurónico, estimula la proliferación y migración celular, y tiene una distribución enriquecida en el embrión de mamífero, razón principal de su aplicación al cultivo de células madre. El hialurano se ha utilizado en la industria médica para el tratamiento de la osteoartritis (OA) como reemplazo del líquido sinovial de baja elasticidad de los pacientes con OA. Esta práctica médica establecida está siendo modificada para la regeneración de discos no vertebrales usando terapia celular, donde las células precursoras mesenquimales humanas (comercializadas por Mesoblast, AU) se inyectan con hialuronano para reparar los discos dañados.
Atrapamiento de células madre con colágeno y seda
Las proteínas de origen natural ofrecen la oportunidad de imitar en los biorrectores el microambiente in vivo que experimentan las células madre con una modificación química limitada (o ausente). La proteína más abundante en el cuerpo de los mamíferos es el colágeno, y su función principal in vivo es proporcionar rigidez a la matriz extracelular; el enlace entre las células y el colágeno puede ser directo o puede lograrse a través de la molécula de fibronectina, que une el colágeno y la integrina de la molécula de la superficie celular a través del motivo RGD. Las isoformas de colágeno I, II, III y V son proteínas fibrosas ubicadas en el área intersticial de los tejidos, mientras que el colágeno IV es parte de la capa basal de la mayoría de los tejidos epiteliales. Como biomaterial, el colágeno es biodegradable, biocompatible, tiene baja inmunogenicidad y se puede extraer de prácticamente cualquier mamífero. Su principal desventaja es la dificultad de esterilización, similar a cualquier otro material a base de proteínas, ya que el vapor y la radiación pueden cambiar fácilmente la conformación de la proteína. En el caso del colágeno, el tratamiento con ácido es el método de esterilización más común, mientras que la inmersión en etanol también es una alternativa.
El colágeno de tipo I es la isoforma que se utiliza en la gran mayoría de aplicaciones de cultivos celulares; estos incluyen cultivos de células madre neurales, hMSC y ESC de ratón. En el último trabajo, Battista y colaboradores, han demostrado que los cuerpos embrioides (EB) de células madre embrionarias de ratón (mESC) diferenciados se inhiben con concentraciones crecientes de colágeno, probablemente debido a una rigidez creciente de los geles. El efecto de la tensión uniaxial sobre la diferenciación osteogénica de hMSC fue demostrado por Sumanasinghe, para aumentar la expresión génica de la proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2) en un 10% en comparación con el control no tensado. El mejor ejemplo de una aplicación comercial que involucra colágeno es los productos de medicina regenerativa para la cicatrización de heridas cuya formulación incluye colágeno.
La fibrina es una proteína que interviene en la coagulación de la sangre; se forma cuando la trombina interactúa con el fibrinógeno y forma el polímero de fibrina. Esta proteína es ideal para aplicaciones terapéuticas ya que sus materias primas se pueden extraer de la sangre de un paciente para realizar la síntesis de fibrina ex vivo, que constituye un producto autólogo degradable que no debería provocar una respuesta inmune cuando se reimplanta en el paciente.
La literatura reporta varias aplicaciones terapéuticas de geles de fibrina para defectos óseos usando hMSC y más recientemente Falanga et al. han informado de la aplicación de una mezcla de hMSC con fibrina en un aerosol para la cicatrización de heridas. Esta proteína también se ha utilizado para la diferenciación neuronal de mESC y para construir válvulas cardíacas artificiales que contienen miofibroblastos humanos primarios.
El uso de la seda como material se originó en la industria textil (que produce alrededor de 4 × 105 toneladas de seda al año) y ha migrado al campo médico hace décadas cuando comenzaron a usarse las suturas de seda. La proteína de la seda es una de las más resistentes de la naturaleza y su módulo de Young varía de 5 a 17 GPa (en comparación con el colágeno que tiene 2 a 50 MPa). La principal ventaja de la seda sobre los biomateriales naturales restantes es que la esterilización con vapor y la irradiación gamma no cambian su estructura. Dada su rigidez, este material, funcionalizado con el péptido RGD, ya se ha utilizado para la diferenciación osteogénica de hMSC y se ha demostrado que regula al alza la expresión de marcadores óseos en comparación con el colágeno. El cultivo y la diferenciación condrogénica de hMSC también se logró en andamios de seda porosa 3D, y también se ha demostrado la expansión indiferenciada de este tipo de células en nanofibras de seda electrohiladas.
Materiales – Péptidos y Cerámica
Los péptidos se componen de secuencias cortas de aminoácidos y típicamente se sintetizan en una reacción química estandarizada en fase sólida entre los extremos C-terminal y N-terminal de los aminoácidos. Zhang y col. sintetizó un péptido que consta de una secuencia alterna de aminoácidos cargados positiva y negativamente con cadenas laterales hidrófobas e hidrófilas alternas; este péptido, llamado RADA16 por su secuencia de aminoácidos, tiene la capacidad de autoensamblarse en láminas 𝛽 estables con una estructura fibrilar muy cercana a la ECM y con un contenido de agua del 99%.
La geometría del material puede variar desde una capa membranosa hasta andamios de hidrogel, que apoyan el crecimiento y la diferenciación de progenitores de hepatocitos y células madre neurales.
En el último trabajo, Zhang han funcionalizado aún más el andamio RADA16 a través de la unión covalente de la secuencia del péptido Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), que se encuentra en la laminina y también se une a los receptores de integrina. La última aplicación comercial de este material es la superficie de acrilato de péptido y matraces y perlas de cultivo celular recubiertos. Se cultivaron células madre embrionarias humanas en la superficie y se diferenciaron con éxito en cardiomiocitos.
A diferencia de RADA16, otros productos están compuestos estructuralmente por superficies de acrilato y los péptidos sintéticos, derivados de motivos ECM, se utilizan principalmente para funcionalizar el sustrato para un destino celular determinado, como la diferenciación de hESC en oligodendrocitos.
Los materiales cerámicos están compuestos de materiales inorgánicos que se mezclan con agua y un aglutinante orgánico para hacer el producto cerámico final. Estos materiales se han utilizado históricamente en cirugía ortopédica por su alto módulo de Young (en comparación con otros biomateriales), donde se clasifican como inertes o bioactivos.
Las cerámicas bioactivas tienen propiedades osteoconductoras que aceleran la curación ósea; estas propiedades se han utilizado para producir armazones cerámicos con osteoblastos derivados de hMSC mediante diferenciación osteogénica.
Toquet y col. fueron de los primeros en demostrar que era posible expandir las hMSC derivadas de la médula ósea en sedimentos macroporosos de fosfato cálcico y, posteriormente, diferenciar estas células en un destino osteogénico.
La actividad osteogénica del fosfato de calcio cuando se usa en la diferenciación de hMSC se debe al hecho de que el calcio es un componente principal del hueso, en forma de hidroxiapatita.
Cuando se sembraron andamios cúbicos con una mezcla de 80% -20% de hidroxiapatita y fosfato tricálcico (TCP) con hMSC y se implantaron ectópicamente en ratones, la tasa de formación de hueso fue significativamente mayor que con cualquiera de los materiales individuales.
Estos ejemplos demuestran la importancia de imitar el entorno in vivo y cómo los materiales que entran en contacto con las células son un factor importante para proporcionar tales señales.
Materiales utilizados en el atrapamiento de células madre.
Los parámetros físicos más críticos de los materiales utilizados en el de atrapamiento de células madre se obtienen en pruebas de tensión-deformación. Estas pruebas han establecido estándares que se pueden encontrar en los sitios web de la Organización Internacional de Normalización (ISO) y la Sociedad Americana de Pruebas y Materiales (ASTM). Las curvas de tensión-deformación obtenidas de estos ensayos relacionan la fuerza normalizada por unidad de área (tensión) aplicada al material con el desplazamiento relativo resultante del material (deformación). Uno de los parámetros más importantes obtenidos en tales pruebas es el módulo de Young (E, en fuerza por unidad de área), que es la pendiente en la región elástica de la curva tensión-deformación y es una medida de la rigidez del material, que se sabe que afecta la señalización intracelular principalmente a través de los receptores de integrina y las quinasas de adhesión focal asociadas. Recientemente, Engler et al. han demostrado que la rigidez de la matriz puede dirigir la diferenciación del atrapamiento de células madre mesenquimales humanas (hMSC) a destinos celulares neuronales, miogénicos y osteogénicos, dependiendo de si el sustrato de poliacrilamida tiene una rigidez menor o mayor. Por lo tanto, el módulo de Young es una propiedad mecánica crítica de los materiales utilizados para cultivar células madre.
Estos materiales pueden clasificarse en materiales sintéticos o naturales, y ambos grupos pueden subdividirse en materiales sintéticos basados en polímeros, péptidos y cerámica, y proteínas, polisacáridos y materiales naturales complejos. El uso de materiales sintéticos posee una ventaja sobre los materiales naturales: un mayor grado de control durante el proceso de fabricación que puede simplificar el control de calidad (QC) y los procesos de aprobación regulatoria en el caso de aplicaciones terapéuticas, ya que la composición de los materiales sintéticos es bien definido. Sin embargo, si los materiales naturales son abundantes y el proceso de extracción / preparación / esterilización / eliminación de endotoxinas es simple, la economía del proceso puede ser más favorable en comparación con sus contrapartes sintéticas. Además, los materiales naturales complejos como Matrigel tienen muchas proteínas de matriz extracelular (ECM) y factores de crecimiento incrustados que proporcionan un microambiente muy favorable para el cultivo de células madre. Independientemente de su origen, el uso de materiales en el cultivo de células madre tiene como objetivo principal aumentar la similitud entre el cultivo y los entornos in vivo.
Los polímeros sintéticos ofrecen la posibilidad de controlar la composición, las propiedades químicas y físicas, así como la tasa de degradación del material. El polietilenglicol (PEG) está aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) para su uso como excipiente y conjugado de fármaco, siendo el ejemplo más notable el conjugado de PEG-interferón-𝛼, que aumenta la solubilidad y vida media de la proteína en el cuerpo humano. Los monómeros de diacrilato de PEG sin modificar se polimerizan típicamente mediante irradiación ultravioleta (UV), formando un polímero que tiene baja adhesión celular y baja unión a proteínas, y está completamente hidratado en solución acuosa. La introducción de modificaciones químicas covalentes antes de la reacción de polimerización puede agregar funcionalidades adicionales como la adhesión celular. Por ejemplo, la reticulación del motivo peptídico de unión a integrina Arg-Gly-Asp (RGD) en hidrogeles de PEG aumenta la propagación celular (adhesión) sobre el polímero y la adición de grupos químicos funcionales también se puede utilizar para dirigir la diferenciación de hMSC . La degradación de los hidrogeles de PEG también se puede ajustar reticulando el polímero con enlazadores peptídicos escindibles como lo muestran Anderson et al. quienes demostraron que los hidrogeles de PEG con una tasa de degradación aumentada también aumentan la eficiencia de la diferenciación de hMSC en linajes osteogénicos, condrogénicos y adipogénicos.
El polímero sintético poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) es un copolímero de los monómeros del ácido glicólico y láctico y, similar al PEG, puede funcionalizarse y su velocidad de degradación puede modificarse químicamente. Se utiliza ampliamente en aplicaciones clínicas como material biodegradable aprobado por la FDA de EE. UU. ejemplos de tales aplicaciones son suturas quirúrgicas (Vicryl®, Johnson y Johnson), injertos y dispositivos protésicos. Los nuevos copolímeros resultantes se sembraron con hMSC y se estudió su interacción célula-polímero. Recientemente, Huang et al. han sintetizado perlas porosas de PLGA, que apoyan el crecimiento de células madre del líquido amniótico humano (hAFSC); estas perlas permitieron que las células crecieran tridimensionalmente sin limitaciones de nutrientes y depositaran componentes de ECM como colágeno III y fibronectina. Estas perlas que contenían hAFSC se inyectaron en ratas que habían sufrido un infarto de miocardio, y estos animales mostraron mejoras significativas en la función cardíaca en comparación con los que recibieron células disociadas sin las perlas.
Ha habido un desarrollo significativo en materiales de atrapamiento de células madre en biorreactores hechos de politetrafluoroetileno (PTFE), que es un material comúnmente utilizado en la industria de dispositivos médicos. La aplicación más notable de PTFE al cultivo de células madre atrapadas son las macrocápsulas en combinación con células productoras de insulina derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC).
Cultivo de células madre atrapadas en biorreactores continuos
Las células madre son células con la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en tipos de células maduras y funcionales. Las aplicaciones de las células madre se pueden dividir en dos áreas: como fuentes de células para modelos in vitro (tanto para modelos de enfermedades como para estudios de toxicología) y para terapias celulares. Como modelos in vitro, las células madre se pueden utilizar para desentrañar los mecanismos fundamentales de aparición, progresión y mitigación o curación de enfermedades y como herramienta para las pruebas de toxicidad. En ambos casos, es deseable que las células madre se diferencien en células de interés, que pueden ser células diferenciadas terminalmente (típicamente para pruebas in vitro y en algunos casos para terapias) o progenitoras expandibles (es más probable que se utilicen en terapias).
Como terapias, las células madre son parte de la medicina regenerativa y la terapia celular, con ensayos clínicos en curso en áreas como diabetes, enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y leucemia linfoblástica aguda, entre otros.
El cultivo de células madre se realiza principalmente utilizando superficies planas como matraces en T en incubadoras de temperatura y atmósfera controladas, que no controlan la composición fisicoquímica del medio de cultivo. El uso de biorreactores para el cultivo de células madre tiene dos ventajas principales sobre estos sistemas: permite el seguimiento y control de los parámetros de cultivo como el oxígeno disuelto (OD) y el pH, y permite una escalabilidad más sencilla y directa, que oscila entre cientos de mililitros a 104 l. Si bien la escalabilidad es fundamental para las terapias con células madre, que requieren un alto número de células y son deseables para la economía del proceso de producción de células madre en general, el control ambiental que permiten los biorreactores es de suma importancia para cualquier cultivo de células madre, ya que estos cultivos ya están afectados por variables relacionadas con la biología celular.
Vale la pena señalar que hay un grado de control decreciente cuando se compara un biorreactor de tanque agitado con la medición y control de OD y pH en el medio de cultivo a granel con un biorreactor de flujo pistón, que puede tener los mismos controles en la entrada del medio y salida pero con conocimiento limitado de los valores de estos parámetros cerca del microambiente celular.
Esta es la razón por la que los cultivos de células madre no escalables (es decir, realizados en matraces T) generalmente requieren un intercambio de medio total o parcial a intervalos de 1 a 4 días, ya sea con fines de expansión o diferenciación. El impacto de estos cambios en la composición del medio de cultivo es proporcional al tiempo de cultivo; es decir, afecta a las culturas de largo plazo más severamente que a las de corto plazo. El uso de un biorreactor continuo añade la composición del medio de cultivo a los parámetros controlados dentro del recipiente y dicho control permite cambiar el medio de cultivo a medida que las células madre progresan hacia un tipo de célula deseado.
El atrapamiento de células madre en un material proporciona un entorno de cultivo tridimensional (3D), que imita el entorno celular in vivo, donde las células están en contacto entre sí y con la matriz extracelular, a diferencia del cultivo en matraz T normal. Además, la necesidad de mezclar y por lo tanto el flujo de fluido en los biorreactores genera cizallamiento; la velocidad de cizallamiento se define como el componente de presión anormal que surge del flujo de fluido. Esto se define como 𝜏= 𝜕v ∕ 𝜕y, donde 𝜏es la tasa de corte y el lado derecho de la ecuación representa el gradiente de cambio del vector de velocidad paralelo a la superficie de la celda con la distancia y desde esta misma superficie. El esfuerzo cortante viene dado por el producto de la velocidad de corte por la viscosidad cinemática de la solución.
El impacto de la cizalladura en la viabilidad, proliferación y diferenciación de las células madre se ha documentado ampliamente, como se comenta más adelante. El atrapamiento de células madre es una tecnología ampliamente utilizada para mitigar estos efectos relacionados con el cizallamiento de los cultivos en biorreactores y, cuando se combina con un medio de alimentación continuo, proporciona un entorno de cultivo de células madre más controlado.
Desde una perspectiva clínica, el material de atrapamiento puede proporcionar una protección física que evita que las células alogénicas sean atacadas por el sistema inmunológico del huésped y también evita que las células implantadas proliferen en el cuerpo del huésped.
Biorreactores y producción de hPSC
Ampliando la discusión sobre biorreactores en la producción de hPSC en el estado pluripotente, proporcionamos un breve estado de la diferenciación cardiomiogénica ascendente de las PSC. Esto no solo refleja la propia experiencia y conocimientos, sino que también representa uno de los campos más avanzados en la producción en masa de hPSC, lo que refleja el enorme potencial terapéutico y socioeconómico de esta investigación.
En general, se pueden subdividir los procesos de producción secuenciales frente a los integrados. La producción secuencial se refiere al procesamiento independiente de células en estado pluripotente en el primer paso, que luego se diferencian en un segundo enfoque, bastante diferente. Esto podría incluir, por ejemplo, la transición del cultivo 2D para la expansión celular a la diferenciación 3D. Tradicionalmente, las estrategias de expansión celular (descritas anteriormente) se han desarrollado y optimizado independientemente de los protocolos de diferenciación. Por el contrario, el procesamiento integrado tiene como objetivo el desarrollo de enfoques de «un solo paso» estrechamente conectados basados en la transición directa de la producción de hPSC en biorreactores a la diferenciación de linaje. Esto podría establecerse cambiando medios específicos, únicamente, que controlan los diferentes pasos del proceso, pero sin una gran adaptación del entorno del biorreactor.
Para establecer condiciones de cultivo definidas químicamente y reducir significativamente los costos, se probaron moléculas pequeñas como el compuesto SB203580, un potente inhibidor de p38 MAPK. La suplementación de SB203580 a los EB diferenciados en cultivo en suspensión a escala de cultivo tisular resultó en una inducción de hasta un 10% de CM a partir de hESC de una manera dependiente de la concentración, lo que permitió el enriquecimiento a> 99% de pureza mediante selección genética.
Más recientemente, se logró una inducción de cardiomiocitos> 80% a partir de las líneas hESC y hiPSC mediante el uso del inhibidor de GSK3𝛽CHIR99021 que desencadena la activación de la vía WNT. Posteriormente, el protocolo emplea la suplementación de inhibidores químicos de la vía de WNT como IWP o IWR en etapas posteriores, lo que refleja un patrón de actividad de WNT bifásica conocido por el desarrollo del corazón. Inicialmente, el protocolo se desarrolló en un formato de monocapa 2D para la expansión y diferenciación de hPSC, lo que limita su aplicación al aumento de escala en reactores agitados.
Para superar estas limitaciones, hemos establecido recientemente una plataforma multipocillo para el cultivo y la diferenciación de hPSC en placas de 12 pocillos de baja adherencia para facilitar la optimización del proceso en un mayor rendimiento. Al mostrar que la inducción cardíaca dependía estrechamente del paso de tratamiento transitorio de CHIR99021, el trabajo permitió la combinación directa de la expansión de hPSC de agregados inoculados de células individuales con la posterior diferenciación cardíaca en un proceso integrado de “un solo paso”. La ampliación a matraces Erlenmeyer rotados en una escala de 20 ml confirmó la solidez del protocolo y la aplicabilidad a varias líneas establecidas de hESC y hiPSC y apoyó la transición final a reactores de tanque instrumentados y agitados. El proceso integrado en una escala de 100 ml permitió combinar directamente la expansión de hPSC basada en agregados, inoculada en una sola célula, seguida de la inducción de hasta un 85% de CM puros en medios definidos, lo que permite la producción de 40-50 millones de CM en una sola ejecución de proceso. También se aceptó recientemente para su publicación una descripción detallada del procedimiento experimental que incluye todos los pasos para la configuración, calibración y resolución de problemas del biorreactor.
Con su eficiencia actual, el proceso en Biorreactores de producción de hPSC podría escalarse potencialmente hasta 2000 ml para la producción de ∼1 × 109 CM humanas en un solo lote, que se ha discutido como una dosis celular terapéutica apropiada para reemplazar la pérdida de CM inducidas por IM. Curiosamente, este rendimiento calculado refleja de cerca nuestros resultados anteriores logrados para la expansión de mESC y la diferenciación cardíaca que demuestra la producción de 1 – 5 × 109 CM, en biorreactores a escala de 2000 ml. Sin embargo, un trabajo reciente sobre la diferenciación cardíaca de hPSC en un reactor de tanque totalmente equipado mostró que las modificaciones del proceso, por ejemplo, mediante el control de OD, pueden aumentar sustancialmente el rendimiento de CM, lo que sugiere un gran potencial de optimización futura.
Tomados en conjunto, el estado actual en el campo del procesamiento de PSC sugiere que el cultivo en suspensión en biorreactores instrumentados tiene un gran potencial para el desarrollo de procesos a escala clínica e industrial, pero aún se requieren avances significativos y pasos de ampliación.
Más allá de modificar la densidad de inoculación, la velocidad de agitación y la concentración de oxígeno, hasta donde sabemos, todavía no se han publicado parámetros de proceso significativos, como el control del pH mediante ciclos de retroalimentación automatizados, para el procesamiento de hPSC.