Optimización y limitaciones del procesamiento de hPSC en biorreactores agitados
Aplicando el enfoque de agregado sin matriz, recientemente se realizaron varias pruebas de optimización en el modo de alimentación por lotes (generalmente realizando un cambio de medio completo una vez al día), equivalente a la estrategia de alimentación típica en el cultivo 2D convencional. Se han publicaron investigaciones exhaustivas sobre la densidad de inoculación y la tasa de agitación en un diseño experimental factorial de dos parámetros y tres niveles, mientras que otros investigadores han probado por separado más parámetros, incluida la tensión de OD en bioreactores instrumentados de tanque agitado. Aunque se demostró una estrecha interdependencia de los parámetros individuales, el progreso general con respecto a la densidad de recolección de células máxima alcanzada fue limitado, lo que sugiere la presencia de condiciones de proceso subóptimas o perjudiciales.
Utilizando tres medios de cultivo de hPSC convencionales, el estudio sugiere que ni la glucosa ni las limitaciones de aminoácidos parecen limitar la proliferación de hPSC cuando se apunta a densidades celulares más altas en cultivo en suspensión, sino más bien la acumulación de subproductos metabólicos como amonio y / o lactato. Dado que las hPSC se basan principalmente en la glucólisis (es decir, en contraste con las células somáticas en las que el metabolismo está dominado por la fosforilación oxidativa) para cubrir su demanda de energía y bloques de construcción metabólicos, la acumulación sustancial de lactato y la acidificación del cultivo son las consecuencias esperadas del aumento de la densidad celular. Esto podría representar un obstáculo importante para lograr rendimientos de procesos específicos más altos, particularmente en el modo de alimentación por lotes, que se ha demostrado que da como resultado patrones de proceso marcados y oscilantes en el intercambio diario de medio en biorreactores instrumentados.
Para generar un entorno de cultivo más homogéneo y lograr una alta densidad celular, la alimentación por perfusión está bien establecida en la biotecnología a escala industrial. Los estudios iniciales sobre hPSC han demostrado de hecho que la alimentación por perfusión puede tener un impacto sustancial en la expansión y diferenciación de PSC en reactores instrumentados 2D y 3D. La perfusión se caracteriza por un intercambio continuo de medio en el recipiente de cultivo por medio fresco, que típicamente se basa en dispositivos de retención de células para evitar el lavado de células del biorreactor junto con el intercambio continuo de medio. La perfusión permite además una mejor automatización del proceso y un mejor control del entorno de cultivo, incluido el pH, la tensión de OD y la concentración de nutrientes y productos de desecho. Además, la capacidad de autoacondicionamiento de las células mediante la secreción de factores estimulantes de crecimiento, que podrían ser controlados por el caudal en perfusión, podría permitir reducir los costosos componentes del medio.
Recientemente, se demostró para las PSC de ratón que la perfusión puede mejorar el rendimiento del proceso y el rendimiento celular en reactores de tanque instrumentados que logran densidades celulares de> 2 × 107 ml-1 mediante el aumento de la tasa de perfusión hasta cinco veces los volúmenes de proceso / día, lo que refleja los resultados anteriores en 2000 ml en reactores instrumentados de nuestro grupo comparando alimentación por lotes y por perfusión. Sin embargo, todavía se dispone de estudios muy limitados sobre cultivos de perfusión de hPSC y no se conocen bien los mecanismos exactos por los cuales la perfusión mejora los rendimientos de PSC.
Procesos de inoculación y estrategias de pasaje.
Debido a su sensibilidad a los pases basados en células individuales, lo que resulta en una pérdida celular esencialmente cuantitativa, las hPSC se pasaban tradicionalmente como colonias o grupos semidisociados en cultivo 2D y la inoculación de cultivos 3D inicialmente también se basó en esta estrategia. Dado que estos grupos de células tendían a adherirse entre sí dando como resultado una fusión extensa, particularmente en cultivos en suspensión estática, se ha sugerido la encapsulación en matrices para controlar este proceso. Las limitaciones de este enfoque incluyen la adición de matrices adicionales al proceso, el requisito de equipo especial y el control limitado sobre cuántas células o grupos quedarán atrapados en una sola cápsula. Otro problema es el estallido incontrolado de tales cápsulas, por ejemplo, en respuesta a la proliferación celular o al esfuerzo cortante en los biorreactores, lo que limita aún más el control y la reproducibilidad del método. Más recientemente, se informó que un polímero funcional denominado «goma de gelan» evita la fusión de los agregados en suspensión. Aunque el concepto subyacente es sólido, el método no admitía la siembra unicelular, sino que requería la interrupción mecánica de los agregados celulares mediante el procesamiento a través de un colador para la inoculación y el pase del proceso.
Por el contrario, el paso de células individuales permite, en principio, un proceso de inoculación completamente definido a una densidad celular preoptimizada. Por lo tanto, la estrategia apoya el control experimental en ciencia básica y facilita sustancialmente el desarrollo de procedimientos operativos estándar (POE) requeridos para los procesos que cumplen con las BPM. La otra ventaja de los pases basados en células individuales es la disociación completa de colonias (2D) y agregados (de 3D) en cada paso de expansión, lo que interrumpe la interacción intercelular prolongada en el núcleo de las respectivas colonias o agregados. La disociación completa interrumpe los contactos establecidos célula-célula, contrarrestando la formación de gradientes locales y el desarrollo de heterogeneidad de cultivo no deseada, lo que potencialmente desencadena una diferenciación incontrolada.
Sin embargo, el prerrequisito para el paso de hPSCs basado en células individuales era el desarrollo de medios de cultivo avanzados y particularmente la suplementación del compuesto químico Y-27632, un potente inhibidor de la quinasa asociado a Rho, que parece apoyar transitoriamente la vitalidad de hPSCs individuales, creando una ventana para la reagregación de hPSC después de la siembra.
Microportadores ocultivos de suspensión sin matriz: Pro y Contra
Una estrategia exitosa para la transición de hPSC a cultivo en suspensión es el uso de microportadores (MC). Se trata de partículas fabricadas a partir de diferentes materiales disponibles en diferentes formas y tamaños, que pueden utilizarse con nuestro sin recubrimiento de matriz adicional. Los MC se introdujeron en el bioprocesamiento para proporcionar células dependientes del anclaje, que son difíciles de adaptar al cultivo en suspensión, con una «superficie flotante» para la unión y, en paralelo, para elevar ampliamente el área de superficie tras la transición a 3D. La expansión de hPSCs sobre MC se ha demostrado con éxito en placas de cultivo estáticas seguidas de condiciones de agitación que incluyen matraces giratorios y biorreactores de tanque agitados instrumentados. A pesar de este éxito, los investigadores han observado la tendencia de las hPSC a adherirse entre sí (en lugar de a los tipos de microportadores preseleccionados), lo que induce un nivel adicional de heterogeneidad de cultivos. Los tipos de MC rígidos también podrían aumentar la tensión de cizallamiento, particularmente en condiciones de agitación, y se observó una fase de retraso extensa en la transición de hPSC a MC en biorreactores. El enfoque también requiere la eliminación potencialmente engorrosa de microportadores de preparaciones de células de grado clínico antes de las aplicaciones clínicas.
Utilizando el producto químico ROCKi en combinación con la disociación enzimática en células individuales para una inoculación más estandarizada, nosotros y otros hemos demostrado la expansión de hPSC indiferenciadas como agregados de células libres de matriz en suspensión estática y en matraces giratorios agitados. En estos estudios de prueba de concepto, se demostró el mantenimiento de la pluripotencia y la estabilidad del cariotipo en numerosos pasajes (es decir, ciclos repetidos de disociación y reagregación agregadas). Posteriormente, se llevó a cabo la transferencia a biorreactores instrumentados de tanque agitado a escala de 100 ml (sistema de reactor DASGIP paralelo, Julich, Alemania) incluyendo la optimización inicial de las densidades de inoculación celular y las condiciones de agitación (como el diseño del impulsor y la velocidad de agitación). Los parámetros clave del proceso, incluida la cinética de crecimiento, el pH, el OD y la concentración de lactato, se controlaron durante los 7 días de duración del proceso.
En comparación con el cultivo en suspensión en placas de plástico, donde las células están más concentradas en el fondo de la placa debido a la gravedad (en lugar de estar distribuidas homogéneamente en 3D completo), inoculadas a ~ 0.5-1 × 105 cellml − 1 aproximadamente cinco a Se requirió una siembra de células diez veces mayor a ~ 5 x 105 células ml-1 para la formación exitosa de agregados en reactores con agitación de impulsor. Posteriormente se consiguieron densidades de recogida de células de aproximadamente 2 x 106 células ml-1 correspondientes a una expansión de tres a seis veces por pase en condiciones de agitación. Por tanto, a pesar del éxito general del método, estos datos solicitan una optimización sustancial del proceso con respecto al rendimiento celular por mililitro de medio y también al rendimiento global del proceso.
Ventajas del uso de biorreactores de tanque agitados instrumentados
Recientemente, el campo está llegando a un consenso de que el cultivo en suspensión 3D tiene un gran potencial para lograr los requisitos extensivos de número de células para la producción y diferenciación de hPSC mediante la optimización sistemática del proceso y el aumento de escala. En este sentido, los biorreactores de tanque agitado totalmente equipados proporcionan numerosas ventajas para el desarrollo de procesos eficientes de cultivo en suspensión, que son las siguientes:
- La agitación controlada por impulsor asegura una mezcla y distribución homogénea de células, nutrientes y gases en todo el cultivo.
- El diseño del impulsor y la velocidad de agitación, además de la densidad de inoculación celular, permiten el control de la agregación celular y el desarrollo de agregados.
- Los reactores de tanque completamente instrumentados (a diferencia de los matraces giratorios simples) permiten monitorear y, lo que es más importante, controlar y modular los parámetros clave del proceso, incluido el pH, el OD y el monitoreo potencialmente en línea de la biomasa viable. Herramientas de proceso adicionales, por ejemplo, para el monitoreo en línea de parámetros metabólicos, se establecen fácilmente para biorreactores más grandes. Actualmente, se están desarrollando herramientas avanzadas para evaluar y controlar mejor las características específicas de las células madre, como el monitoreo no invasivo sin etiquetas de la pluripotencia de las células frente a la diferenciación y la microscopía 3D automatizada de agregados de células suspendidas y es probable que se implementen en biorreactores agitados en un futuro próximo.
- Los puertos respectivos permiten el muestreo simple y regular de células y medios para un análisis adicional fuera de línea.
- Los puertos de entrada y salida en combinación con respecto a los sistemas de retención de células permiten un rendimiento medio constante, lo que permite estrategias de alimentación más flexibles y controladas. Esto permite, por ejemplo, aplicar la alimentación por perfusión, que tiene ventajas sustanciales en comparación con la alimentación por lotes típica mediante un solo bolo medio aplicado típicamente en cultivo de tejidos 2D y para reactores convencionales de matraz giratorio.
- Los sistemas de biorreactores de tanque paralelos a pequeña escala que consisten en numerosos recipientes controlados y monitoreados de forma independiente apoyan el desarrollo del proceso multiparamétrico; la disponibilidad de sistemas de reactores más grandes físicamente equivalentes apoya posteriormente el aumento de escala del proceso lineal relativo.
- Los recipientes de cultivo desechables que cumplen con las GMP y que están disponibles en la mayoría de las dimensiones del proceso permiten la traducción clínica.
Debido a estas ventajas, la tecnología de los reactores de tanque agitado se utiliza ampliamente en las industrias biotecnológicas para la optimización y posterior producción en masa de proteínas recombinantes y vacunas a partir de líneas celulares de mamíferos establecidas como células CHO, HeLa y HEK293, por lo que los procesos establecidos en> 1000 l Se han establecido reactores a escala. Sin embargo, los respectivos bioprocesos tienen como objetivo la producción de productos derivados de células, como proteínas o vacunas, únicamente, prestando una atención limitada a las características biomédicas de las células. Este enfoque está en marcado contraste con la producción prevista de células madre y sus progenies para las terapias celulares. Debido a las condiciones de cultivo relativamente complejas para las CEP (así como para otros tipos de células madre como las CMM y las células madre hematopoyéticas (CMH)) en el estado pluripotente y el régimen de diferenciación, a menudo aún más laborioso, necesario para la derivación de la mayoría de tipos de células específicas El procesamiento de PSC en reactores de tanque agitado está todavía en su infancia.
Debido a esta complejidad, las dimensiones del proceso actual se centran en ensayos de optimización de escala de 100 ml, como máximo. Los altos costos de los medios de diferenciación y cultivo específicos de células madre, que a menudo incluyen componentes sujetos a variación de lote a lote, como la albúmina de suero bovino (BSA) o humano (HSA), ralentizan aún más este campo de investigación.
Finalmente, la transición del cultivo de hPSC 2D establecido hacia la suspensión agitada ha sido un desafío debido a las características inherentes de las células, como se describe con más detalle en las siguientes secciones.
Las mESC, que se establecieron en 1981 y, por tanto, mucho antes que las hESC de 1998, así como las iPSC de ratón / humano en 2006/2007, se utilizaron inicialmente como modelo para el desarrollo del proceso de PSC. y ampliación.
Está bien establecido que las mESC se pueden cultivar como agregados celulares al menos para la inducción de la diferenciación, que luego se denominaron cuerpos embrioides (EB) debido a su potencial de diferenciación multilinaje. Los primeros trabajos mostraron que la inoculación de mESC como células individuales en cultivo en suspensión seguido de una condición dinámica (es decir, rotación o agitación) apoya la formación de EB más homogéneos en comparación con los controles estáticos, que inducen una fusión celular y agregada perjudicial. Estas observaciones condujeron primero a procesos para la expansión de masa combinada y la diferenciación de mESCs en biorreactores totalmente instrumentados y agitados en una escala de 2000 ml. Es importante destacar que este trabajo demostró que la agregación de mESC se puede controlar mediante las condiciones de agitación, es decir, la velocidad de agitación. Utilizando líneas de mESC diseñadas por ingeniería, estos estudios también demostraron la inducción de un rendimiento celular relativamente alto de ~ 1 × 107 mESC ml − 1 durante una fase combinada de expansión y diferenciación celular.
Además, se demostró la producción exitosa de hasta ∼109 CM murinas en un solo ciclo de biorreactor a escala de 2000 ml, por lo que el enriquecimiento genético permitió> 99% de pureza de CM. Se logró una mayor optimización del proceso mediante la transición de la alimentación por lotes a la perfusión y dio como resultado un aumento de ~ cinco veces en el rendimiento de CM, lo que permitió cosechar hasta 4,6 × 109 CM en una sola corrida de biorreactor a escala de 2000 ml. Sin embargo, estos primeros experimentos con mESC se basaron en el uso de medios de cultivo complementados con suero de ternero fetal (FCS), rico en mitógenos y pobremente definido. También debe tenerse en cuenta que las mESC tienen una tasa de proliferación significativamente mayor, lo que corresponde a un tiempo de duplicación de la población (TFD) tres veces más corto de 12-16 h en comparación con ~ 36 h para las hESC. Además, a diferencia de sus homólogos humanos, las PSC de ratón también son menos sensibles con respecto a la viabilidad de las células después de la disociación, lo que favoreció la inoculación del proceso de cultivo mediante suspensiones de células individuales para el control posterior de la agregación celular en biorreactores agitados.
Tecnologías para la expansión de células madre pluripotentes
El mantenimiento convencional y la expansión de hPSC indiferenciadas a escala de laboratorio depende de la adherencia a los sustratos, lo que puede denominarse cultivo plano o bidimensional (2D). El cultivo de colonias de hPSC se realiza típicamente en placas convencionales o matraces en T, ya sea en cocultivo con células de fibroblastos mitóticamente inactivadas (denominadas «células alimentadoras») o en extracelulares. Originalmente, este tipo de cultivo se basaba en el paso de colonias de células semidisociadas como pequeños grupos de células que daban como resultado proporciones semicuantitativas, sólo de división.
Estos enfoques de cocultivo son engorrosos para el uso rutinario y representan obstáculos excesivos para la ampliación. Por lo tanto, el reemplazo de células alimentadoras por matrices naturales semidefinidas, proteínas recombinantes o agentes completamente sintéticos que permiten el cultivo de tipo «monocapa» de hPSC en combinación con medios de cultivo acondicionados con células no alimentadoras definidas representan importantes avances en el campo. Los avances en el cultivo de hPSC también han apoyado el cultivo automatizado mediante sistemas robóticos. La automatización permite estandarizaciones independientes del investigador y una mayor producción de muestras. En particular, la automatización de los protocolos de reprogramación de células somáticas facilitará la derivación estandarizada de un gran número de clones de hiPSC individuales, respaldando así grandes proyectos en curso que tienen como objetivo la generación y almacenamiento de un gran número de líneas de hiPSC específicas para pacientes y enfermedades.
Superando la producción de hPSC en 2D
Al multiplicar el manejo manual o automatizado de las placas de cultivo convencionales o al usar matraces de varias capas, la ampliación, en lugar de la ampliación, del cultivo 2D para la producción de células en masa de hPSC se considera generalmente factible. Sin embargo, esto todavía requerirá un espacio relativamente grande. Dado que el espacio y el tiempo para la producción de células terapéuticas en las instalaciones de salas blancas son factores de costo esenciales, estos enfoques de escalamiento horizontal están obviamente restringidos por los aspectos económicos del bioprocesamiento. Otro problema del enfoque de escalamiento en el cultivo convencional adherido a plástico es la capacidad limitada de monitorear y controlar los parámetros clave del proceso, como la evaluación continua y precisa de la proliferación celular, el monitoreo en línea del pH y el oxígeno disuelto (OD), el consumo de glucosa, producción de lactato y otros factores valiosos relacionados con el proceso. Este hecho hace que el desarrollo, el control y la extensión adecuados del proceso de producción sean bastante desafiantes.
Transición respaldada por hidrogel a 3D
Recientemente se ha sugerido el uso de hidrogeles sintéticos, potencialmente compatibles con GMP, como medio de transición hacia el cultivo de hPSC tridimensional, que podría imitar razonablemente el in vivo que apoya transitoriamente la proliferación de células madre. El formato de hidrogel admite la siembra controlada de una sola célula y permite la expansión en serie a largo plazo de las líneas de hPSC con un alto rendimiento de hasta ~ 2,0 × 107 células ml − 1 de hidrogel. La siembra de células en hidrogeles podría ser potencialmente compatible con un formato de biorreactor de lecho empacado, que podría usarse para ampliar esta técnica desde la escala actual de cultivo de tejidos a una dimensión de proceso más grande, incluido el uso de herramientas típicas de monitoreo de procesos como pH y DO. Si se puede demostrar la compatibilidad con la expansión y diferenciación masiva de hPSC, la técnica podría ser valiosa para estrategias autólogas y alogénicas para la producción de células terapéuticas.
Biorreactores para la expansión de células madre pluripotentes
Requisito de las terapias celulares avanzadas para la reparación del corazón
Los trastornos cardiovasculares (ECV) representan las causas más importantes de muerte prematura en los países desarrollados. Estadísticas recientes demuestran que el 28% de las muertes prematuras en hombres y el 19% en mujeres menores de 75 años son el resultado de ECV. Las placas ateroscleróticas que restringen la luz y la flexibilidad de los vasos coronarios en el corazón a menudo preceden al infarto de miocardio (IM). La oclusión definitiva de un vaso puede desencadenar un IM al interrumpir el suministro de oxígeno y nutrición al área afectada. La isquemia tisular y la reperfusión subsiguiente pueden inducir la pérdida irreversible de miles de millones de cardiomiocitos (MC). Dado que los MC en el corazón humano maduro están detenidas en el ciclo celular, no muestran una proliferación prominente, si es que la hay. La evidencia reciente también ha desafiado la presencia de una población de células madre de potencial regenerativo relevante en el corazón. En consecuencia, en lugar de la regeneración de tejidos, se forma una cicatriz fibrótica acinética en el área afectada. Esta afección generalmente conduce a una función cardíaca reducida y, en última instancia, puede resultar en insuficiencia orgánica. La única opción curativa, el trasplante de corazón, está limitada por la falta de donantes de órganos. A pesar de los avances sustanciales en la ingeniería de los dispositivos de asistencia ventricular izquierda (DAVI), una máquina que conecta a los pacientes con insuficiencia cardíaca aguda con el trasplante de órganos, la técnica aún se ve obstaculizada por graves limitaciones. Estos incluyen infecciones frecuentes así como el alto riesgo de trombosis, que puede ocurrir a pesar de la necesidad de tomar fármacos diluyentes de la sangre que, por sí mismos, pueden provocar efectos secundarios indeseables como hemorragias incontroladas.
Por tanto, la terapia celular se ha concebido como una estrategia prometedora para la reparación del corazón. El objetivo es lograr la reparación tisular mediante la entrega ectópica de células al órgano, ya sea para estimular la regeneración endógena del corazón o para reemplazar directamente las MC perdidas por las células del donante trasplantadas. A pesar de los numerosos ensayos clínicos centrados en el trasplante de células propias del paciente derivadas, por ejemplo, de músculo esquelético, médula ósea o sangre periférica al corazón limitado, solo se logró la recuperación de la función cardíaca. Además, se ha negado la generación hipotética de MC por «transdiferenciación» de las células adultas (madre o progenitoras) de los pacientes después de un parto cardíaco. En la actualidad se acepta ampliamente que algunos subtipos específicos de células madre o progenitoras adultas, en particular las de la médula ósea, pueden estimular la recuperación del corazón mediante la liberación de factores paracrinos que desencadenan eventos moduladores de células y tejidos, como la disminución de las MC inducidas por MI, pérdida y / o revascularización tisular mejorada después de un IM. Sin embargo, queda por demostrar que estos efectos son lo suficientemente sustanciales como para mejorar significativamente la condición de los pacientes a largo plazo.
Estrategias basadas en células madre pluripotentes para la reparación del corazón
Un concepto alternativo apunta a reemplazar el tejido cardíaco dañado mediante el trasplante de MC genuinos generados in vitro, solos o en combinación con otros linajes. Los tipos de células que podrían fomentar la reparación del corazón cuando se cotransplantan con MC incluyen células endoteliales y pericitos para estimular la vascularización del injerto, fibroblasto formador de tejido conectivo y matriz extracelular, así como células madre mesenquimales (MSC), que han sido demostrado que actúa inmunomodulador y libera factores de pro-supervivencia, estimulando así el injerto de células del donante en el co-trasplante al corazón.
Todos estos tipos de células se han obtenido recientemente con eficiencias crecientes a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC), incluidas las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), como se ha demostrado para las células endoteliales, pericitos y CMM, así como CM bona fide. Además de su potencial para diferenciarse esencialmente en cualquier tipo de célula somática, las células madre pluripotentes (PSC) tienen la propiedad de proliferación ilimitada en el estado pluripotente, en condiciones de cultivo apropiadas. Mientras que las células madre embrionarias (ESC) han planteado preocupaciones éticas debido a su origen de embriones humanos en etapa de blastocisto, las hiPSC se derivan mediante la reprogramación de células somáticas. La tecnología iPSC no solo está superando problemas éticos, sino que también permite la derivación de PSC específicas del paciente, lo que, en principio, debería evitar el rechazo de las progenies derivadas de iPSC cuando se trasplantan al paciente de origen. Además, la tecnología abre la excitante posibilidad de establecer in vitro modelos de enfermedades específicas de pacientes y tejidos.
Con respecto al corazón, se han sugerido una gran cantidad de estrategias para la reparación de tejidos basada en hPSC, incluida la inyección transmural directa de CM derivadas de hPSC solas o en combinación con otras células y matrices, que se probó inicialmente en roedores modelos. Alternativamente, se considera el trasplante de láminas de células de múltiples capas o construcciones o parches de ingeniería de tejidos más sofisticados. Los obstáculos conocidos incluyen la escasa retención de células inyectadas en el tejido cardíaco, las bajas tasas de supervivencia in situ debido a condiciones hipóxicas, proapoptóticas, inflamatorias e inmunológicas, y la falta de estrategias sencillas para controlar y orquestar la , integración electromecánica de MC de donantes con células del músculo cardíaco endógenas. Recientemente, sin embargo, se demostró la formación exitosa de injertos sustanciales de CM derivadas de hESC en corazones infartados de primates no humanos. Además, utilizando enfoques de ingeniería de tejidos o agregados multicelulares, trabajos recientes también permitieron la implantación y seguimiento de derivados de hPSC en modelos porcinos de daño cardíaco. Además de los primates no humanos, los cerdos se encuentran entre los modelos más apropiados con respecto a la fisiología y fisiopatología del corazón humano, incluida una frecuencia de latido y un tamaño de órganos equivalentes. Si bien los roedores han sido muy útiles para demostrar la prueba de concepto para el acoplamiento funcional de CM derivadas de células madre embrionarias de ratón (mESC) a células endógenas del músculo cardíaco, los corazones de ratones y ratas se consideran de uso limitado para probar el acoplamiento electromecánico de CM derivadas de hPSC, ya que tienen una frecuencia de latido de cuatro a seis veces mayor en comparación con los humanos; Los conejillos de indias que tienen una frecuencia cardíaca de ~ 250 latidos por minuto (lpm) se han sugerido como una alternativa potencial, por lo que se encuentran en la interfase entre ratas (~ 400 lpm) y ratones (~ 600 lpm) en un extremo del espectro y cerdos, primates no humanos y el hombre (~ 60 – 200 lpm) en el otro extremo.
En particular, se publicó recientemente un primer estudio de caso de un paciente humano que recibió células progenitoras cardíacas derivadas de hESC, lo que demuestra que la tecnología está a la vanguardia de la traducción clínica. Esto resalta que, además de la producción de un gran número de células, se requiere urgentemente el procesamiento estandarizado de hPSC y sus progenies en condiciones que cumplan con las buenas prácticas de fabricación (GMP). Los respectivos procesos de producción de células serán obligatorios para facilitar el inicio de ensayos clínicos significativos destinados a probar la viabilidad y, lo que es más importante, la seguridad de las terapias celulares previstas. Sin embargo, para realizar pruebas funcionales preclínicas de CM derivadas de hPSC en modelos animales grandes se requiere fácilmente la producción robusta de miles de millones de células equivalentes a las dosis de células terapéuticas estimadas para el hombre, mucho antes de la aplicación clínica de rutina.
Las células madre y su potencial
Las células madre caracterizadas por su potencial para crecer y diferenciarse en tipos celulares específicos in vitro podrían resolver el problema de la escasa disponibilidad de células en el desarrollo del hígado bioartificial. Además, el riesgo de reacciones inmunológicas en la terapia de trasplante celular se puede evitar si se utilizan células autólogas del paciente. Se están investigando diferentes tipos de células madre. De acuerdo con su potencial de diferenciación, se pueden dividir en células madre pluripotentes representadas por células madre embrionarias (ES) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), y células madre específicas de tejido (células madre «adultas») descritas en el hígado como células madre hepáticas, hepatocitos pequeños o células progenitoras. Los requisitos de la aplicación clínica específica deben tenerse en cuenta al elegir el tipo de célula madre que se utilizará. Una de las principales ventajas de las células madre «adultas» específicas de tejido sobre las células madre pluripotentes es su menor riesgo de desarrollos celulares no deseados, es decir, la formación de tumores y, en consecuencia, una mayor seguridad clínica, que facilita la traducción clínica de los resultados de la investigación in vitro.
Se han informado varios métodos para el aislamiento, cultivo y diferenciación de células madre hepáticas derivadas de hígado fetal o adulto. Los estudios in vitro sobre células madre hepáticas derivadas de tejidos mostraron que su comportamiento de cultivo está influenciado en gran medida por el suministro de citocinas, factores de crecimiento, hormonas y proteínas de la matriz extracelular. Los cultivos de células hepáticas humanas expuestos al plasma de pacientes con insuficiencia hepática aguda durante la terapia de soporte hepático clínico mostraron una mayor evidencia de activación del progenitor enfatizando la importancia de los factores regenerativos. Sin embargo, aún no se ha logrado la proliferación a gran escala de células progenitoras del hígado, lo que hasta la fecha restringe las aplicaciones clínicas de las células.
Debido a su mejor capacidad de crecimiento en comparación con los hepatocitos adultos, las células hepáticas fetales ofrecen la opción de ser utilizadas en sistemas de soporte hepático, pero también podrían expandirse en biorreactores para trasplante celular clínico. El trasplante intraesplénico de células hepáticas fetales en pacientes con enfermedad hepática crónica en etapa terminal fue bien tolerado y seguro, y mostró algunos efectos positivos en las puntuaciones clínicas. Los estudios en biorreactores de cuatro compartimentos perfundidos mostraron la idoneidad de los sistemas de cultivo 3D para apoyar el crecimiento y la maduración de las células fetales. Sin embargo, el uso de células fetales está restringido por preocupaciones éticas sobre el uso de tejido fetal.
Otro enfoque prometedor se basa en el uso de células progenitoras derivadas del páncreas de rata, que se diferencian en células hepáticas mediante la adición de dexametasona. Las células diferenciadas (células B-13 / H) mostraron una expresión estable de marcadores hepáticos, incluidas las actividades enzimáticas del citocromo P450 típicas del hígado, y mostraron un injerto específico del hígado en ratones. Por tanto, si el método se puede transferir con éxito a células humanas, pueden presentar una fuente fácilmente renovable y rentable de células funcionales similares a los hepatocitos.
Las células madre pluripotentes tienen la ventaja de una proliferación ilimitada in vitro y, por tanto, pueden usarse para generar grandes cantidades de células para una posible aplicación terapéutica. Los protocolos para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias humanas en células hepáticas se basan principalmente en un procedimiento de dos pasos, utilizando varios cócteles de citocinas en programas de tiempo definidos para madurar las células primero en células endodérmicas, seguido de la maduración completa en células similares a los hepatocitos. Sin embargo, el uso de células madre embrionarias humanas está en debate debido a preocupaciones éticas sobre la generación de células a partir de blastocistos humanos.
Durante los últimos años, las células iPS humanas generadas mediante la reprogramación genética de células de tejido adulto han ganado una importancia cada vez mayor en la investigación con células madre. El uso de células iPS podría resolver el problema de la escasa disponibilidad de células para la regeneración de tejidos clínicos y el soporte de órganos. Un beneficio importante de las células es que se aceptan éticamente y se pueden generar principalmente a partir de las propias células del paciente para su uso en terapia autóloga. Así, las células iPS brindan la opción única para resolver los principales problemas de la medicina basada en células: la escasa disponibilidad de células adecuadas para la regeneración de órganos y el riesgo de reacciones inmunes en el caso de utilizar células xenogénicas. Dentro del alcance del desarrollo de nuevas terapias basadas en células de enfermedades hepáticas, las células derivadas de iPS corregidas genéticamente también podrían usarse para reparar enfermedades metabólicas genéticas, si se puede demostrar la seguridad de las células.
La disponibilidad de células derivadas de células iPS para uso clínico está actualmente limitada por los métodos existentes utilizados para expandir y diferenciar las células in vitro. Los protocolos actuales para la diferenciación hepática de células iPS se basan en la adición secuencial de diferentes combinaciones de factores de crecimiento y hormonas. Se intentó una maduración mejorada, por ejemplo, aplicando un protocolo basado en citocinas y moléculas pequeñas para la diferenciación directa de células madre embrionarias y células iPS en células hepáticas. Sin embargo, el rendimiento funcional de las células hepáticas derivadas de iPS sigue siendo insuficiente. Las investigaciones de la diferenciación espontánea de células ES de ratón o humanas en biorreactores perfundidos sugieren que se puede lograr una mejor diferenciación celular y formación de tejido en condiciones de biorreactor. Los estudios sobre la diferenciación hepática de células ES humanas indican que las técnicas de cultivo 3D también pueden ser adecuadas para promover la diferenciación específica del hígado de las células iPS.
En la misma línea de evidencia, se informó que el cocultivo de células iPS con células endoteliales y células madre mesenquimales en una matriz presolidificada resultó en la formación de estructuras 3D que mostraron altos niveles de funciones específicas del hígado después del trasplante en un modelo de ratón experimental.
La expansión de las células madre pluripotentes para la diferenciación está actualmente limitada por los métodos de trabajo intensivo para propagar las células en su estado indiferenciado. Además, el control de la proliferación celular y la dirección de la diferenciación celular para una aplicación clínica segura sigue siendo un desafío. Por lo tanto, se necesitan tecnologías de cultivo mejoradas para que las células estén disponibles para terapias de trasplante o soporte de órganos clínicos. En este contexto, el desarrollo de tecnologías específicas de biorreactores 3D parece ser importante también para el desarrollo de modelos de cultivo individuales para aplicaciones terapéuticas.
Fuentes celulares para biorreactores hepáticos bioartificiales
Un obstáculo importante para el uso clínico de los sistemas de biorreactores hepáticos bioartificiales es la falta de fuentes celulares eficientes y seguras para tales terapias. La fuente de células ideal sería de origen humano, mostraría todas las funciones típicas del hígado y sería expandible y libre de cualquier riesgo clínico para el paciente. En la última década, se han logrado avances significativos en las fuentes celulares de hepatocitos para el hígado bioartificial. Los enfoques incluyen células primarias, líneas de células hepáticas y células progenitoras o madre de diferentes orígenes.
Células primarias del hígado
Las células primarias de hígado porcino se han utilizado en varios dispositivos debido a su buena disponibilidad y funcionalidad in vitro. Se ha discutido un posible riesgo de transferencia de retrovirus endógeno porcino (PERV) durante la aplicación en pacientes, pero hasta la fecha no hay evidencia de infección por PERV en pacientes o de liberación de partículas infecciosas por células de hígado porcino cultivadas en hígados bioartificiales. Sin embargo, se necesita una vigilancia cuidadosa de los pacientes para detectar cualquier indicio de transmisión del virus. Además, el uso de tipos de células xenogénicas se asocia con un mayor riesgo de episodios de rechazo, y su desempeño metabólico muestra algunas diferencias con el metabolismo humano debido a diferencias entre especies.
Las células primarias de hígado humano representan la fuente celular de elección debido a su funcionalidad y seguridad clínica equivalentes en humanos. En un estudio piloto clínico realizado con el dispositivo MELS, se utilizaron células hepáticas humanas primarias de órganos de donantes descartados debido a una lesión orgánica (esteatosis, fibrosis / cirrosis, deficiencias vasculares), lo que demuestra la viabilidad de cultivar células hepáticas humanas primarias en sistemas de biorreactores específicos. Sin embargo, la escasa disponibilidad de hepatocitos humanos primarios en cantidad y calidad suficientes para la aplicación clínica restringe su uso en estudios clínicos. Además, la logística del aislamiento celular es extremadamente exigente. En el caso de utilizar células hepáticas primarias recién aisladas, se necesitan al menos 48 – 72 h desde la siembra celular hasta la aplicación terapéutica para permitir la recuperación celular del aislamiento y la adaptación al entorno de cultivo. En caso de insuficiencia hepática aguda, se debe proporcionar un soporte orgánico temporal de inmediato, lo que requiere la disponibilidad de sistemas a pedido que se pueden entregar listos para usar. Dado que la vida útil de las células primarias en los sistemas in vitro es limitada, los sistemas basados en células primarias deben estar constantemente disponibles y renovarse regularmente para estar preparados para uso clínico en caso de que un paciente necesite terapia. Por tanto, la posibilidad de almacenar los dispositivos de cultivo hasta su aplicación mejoraría enormemente la logística de las terapias hepáticas bioartificiales. La criopreservación de células podría resolver el problema del tiempo limitado de supervivencia de las células in vitro. Durante las últimas décadas se han investigado varios enfoques para la criopreservación de hepatocitos. Por ejemplo, los hepatocitos de rata encapsulados en microperlas de alginato al 2% y sometidos a un procedimiento complejo de congelación / descongelación mostraron funciones bien conservadas y se trasplantaron con éxito en un modelo experimental animal. En un enfoque similar, otros autores describieron un método para el almacenamiento de esferoides de células hepáticas encapsuladas en alginato a −80 ∘C o −170 ∘C durante un máximo de 1 año. Sin embargo, aún no se ha demostrado el aumento de los métodos de criopreservación para el número de células terapéuticas.
Como alternativa a las células primarias de hígado humano o porcino, se están investigando líneas de células hepáticas humanas para su uso en sistemas hepáticos bioartificiales debido a su considerable disponibilidad y viabilidad. La línea celular humana C3A, un derivado de la línea celular HepG2, se ha utilizado en ensayos clínicos con el sistema ELAD. Sin embargo, las células C3A muestran un nivel insuficiente de algunas funciones hepáticas importantes, incluida la desintoxicación del amoníaco y la síntesis de urea, y por lo tanto no son ideales para reemplazar las funciones del órgano nativo. La modificación genética de líneas celulares de hepatoma puede ser una forma de aumentar el rendimiento funcional de las células. Recientemente, se informó que la transfección de células HepG2 con aumentador de la regeneración hepática humana (hALR) conduce a un aumento de la producción de 𝛼-fetoproteína, urea y albúmina en comparación con las células HepG2 no transfectadas.
La línea celular HepaRG derivada del carcinoma hepatocelular humano representa una fuente celular prometedora para el desarrollo hepático bioartificial, ya que muestra una variedad de funciones específicas del hígado, incluido el metabolismo dependiente del citocromo P450. La línea celular tiene la capacidad de diferenciarse tanto en hepatocitos como en células biliares cuando se trata con dimetilsulfóxido. Las células HepaRG cultivadas en el biorreactor AMC mostraron un mayor rendimiento funcional en comparación con los cultivos en monocapa 2D en términos de eliminación de amoniaco, producción de urea y actividad del citocromo P450 3A4.
El tratamiento de ratas con insuficiencia hepática inducida con células HepaRG cultivadas en AMC-BAL aumentó el tiempo de supervivencia de los animales en ~ 50% en comparación con el tratamiento con BAL libre de células. Además, en el AMC-BAL se demostró la secreción de ácidos biliares, incluida la hidroxilación, la conjugación y el transporte de sales biliares. El cultivo de HepaRG en biorreactores de fibra hueca de cuatro compartimentos mostró actividades metabólicas estables de varias enzimas del citocromo P450 relevantes para el ser humano durante hasta 4 semanas. Los estudios histológicos realizados en el sistema de biorreactor demostraron la presencia de estructuras biliares y similares a hepatocitos entre los capilares. Por tanto, las células HepaRG podrían ser de interés para los sistemas hepáticos bioartificiales para construir un sistema biliar para drenar la bilis producida por los hepatocitos.
Biorreactores extracorpóreos y producción de células para trasplantes
Si bien los sistemas de biorreactores extracorpóreos ofrecen una opción para el apoyo temporal del hígado defectuoso, se podrían usar métodos para la aplicación intracorpórea de células o tejidos diseñados in vitro para lograr la recuperación permanente del hígado enfermo. El trasplante de hepatocitos humanos primarios en el hígado o el bazo se ha investigado en varios estudios clínicos. Las terapias se realizaron para ayudar a los pacientes con insuficiencia hepática aguda a fulminante o para curar a los pacientes con trastornos metabólicos hereditarios, como hipercolesterolemia genética, enfermedad por almacenamiento de glucógeno, defectos del ciclo de la urea o deficiencia del factor VII de la coagulación. Estos estudios demostraron la viabilidad técnica del trasplante de células y, en algunos casos, se observó alivio de los parámetros sanguíneos y / o mejoría clínica. Sin embargo, el bajo número de pacientes incluidos en esos estudios impide una evaluación definitiva de la eficacia de la terapia.
Los principales obstáculos para una aplicación más generalizada de este procedimiento son (i) la disponibilidad limitada de células hepáticas humanas primarias, (ii) el volumen limitado de células trasplantables que se puede aplicar sin riesgo de trombosis vascular y (iii) la necesidad de terapia inmunosupresora Aplicaciones de hepatocitos no autólogos. Para permitir aplicaciones clínicas seguras, las células generadas deben ser estables durante el mantenimiento in vitro y después del trasplante en el órgano objetivo, al menos hasta la auto-recuperación del tejido, o permanentemente si la auto-reparación no es posible.
Las técnicas de cultivo 2D estáticas utilizadas actualmente proporcionan un entorno poco fisiológico para las células cultivadas. Además, difícilmente es posible una mejora de los modelos de cultivo 2D para cantidades de células más grandes. Se supone que el cultivo celular en condiciones 3D se aproxima mejor al medio fisiológico que los cultivos 2D al mejorar los contactos físicos de célula a célula, la acumulación de matrices extracelulares y el suministro de factor de crecimiento local. En este contexto, las tecnologías de biorreactores y tanques de acero parecen importantes en términos de producción de células a gran escala en condiciones in vitro reproducibles y controlables. El desarrollo de la tecnología de biorreactores puede facilitar la expansión celular al proporcionar mejores condiciones para mejorar la entrega del factor de crecimiento y la estimulación paracrina del crecimiento celular.
Por ejemplo, se demostró la expansión exitosa de células madre embrionarias en sistemas de cultivo basados en microportadores. La importancia de la perfusión celular se demostró tanto en cultivos 2D como en unbiorreactor perfundidobasado en microportadores con control de oxígeno. Sin embargo, un nivel superior de cultivos de microportadores está limitado por la necesidad de pases frecuentes asociados con pérdidas celulares sustanciales. La generación de grandes cantidades de hepatocitos a partir de células madre embrionarias de ratón se investigó en un biorreactor rotatorio de microgravedad simulado provisto de hormonas y factores de crecimiento exógenos. Las células derivadas del cuerpo embrioide cultivadas en el biorreactor rotatorio exhibieron niveles más altos de genes y proteínas hepáticos que las células cultivadas en cultivo estático. Además, en un modelo de trasplante experimental se demostró un injerto exitoso en los hígados receptores de ratones desnudos.
El aumento de la expansión de células madre embrionarias de ratón en biorreactores de fibra hueca de cuatro compartimentos con un volumen de 8 ml u 800 ml dio como resultado la generación de un número de células de 5 × 109 células en un biorreactor de 800 ml, según lo determinado por los parámetros metabólicos y el ADN / cuantificación de proteínas. El análisis de la expresión del marcador confirmó la conservación de la pluripotencia en las células durante la expansión.Para que las células generadas in vitro estén disponibles para uso clínico en el trasplante de células, deben desarrollarse métodos para la diferenciación celular dirigida, así como tecnologías de recolección adecuadas que permitan la generación de células vitales y funcionales para tales aplicaciones. Una condición previa importante es la disponibilidad de una fuente de células adecuada para obtener células hepáticas que garanticen la seguridad clínica de las aplicaciones.
La necesidad de terapias hepáticas innovadoras.
La insuficiencia hepática como consecuencia de una enfermedad hepática crónica progresiva o aguda representa una situación potencialmente mortal que puede conducir a un coma hepático y finalmente a la muerte si no se trata adecuadamente. Las terapias convencionales disponibles, aunque a menudo son beneficiosas para el alivio de los síntomas clínicos, no son eficaces en el tratamiento causal de la enfermedad hepática aguda sobre crónica o aguda. Por tanto, hasta la fecha, la única terapia eficaz de la insuficiencia hepática terminal es el trasplante de hígado. La introducción del trasplante de hígado como opción terapéutica ha reducido significativamente la mortalidad de los pacientes con insuficiencia hepática aguda. Los avances logrados en las últimas décadas en técnicas quirúrgicas, cuidados intensivos, régimen inmunosupresor y métodos de conservación de órganos han hecho del trasplante de hígado una forma de terapia bien establecida y exitosa.
Sin embargo, la escasez existente de órganos de donantes disponibles no permite una expansión significativa de los programas de trasplante, y el número de pacientes en lista de espera para trasplante supera ampliamente el número de órganos de donantes disponibles para trasplante. Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar terapias alternativas o complementarias al trasplante de hígado. Se pueden concebir dos enfoques terapéuticos principales: soporte hepático temporal para unir la función del órgano hasta el trasplante o hasta la regeneración del propio hígado o curación permanente del órgano mediante trasplante de células para reparar el tejido dañado.
Requisitos de los sistemas de soporte hepático.
Para proporcionar un soporte temporal exitoso del órgano defectuoso en la enfermedad hepática en etapa terminal, se deben tener en cuenta las complejas funciones metabólicas de las células hepáticas. Las funciones principales del hígado son (i) transformación de metabolitos endógenos (p. Ej., Amoníaco) o componentes tóxicos exógenos (p. Ej., Fármacos, productos químicos) en metabolitos no tóxicos, (ii) regulación de moléculas pequeñas, en particular aminoácidos, carbohidratos y grasas ácidos, y (iii) la síntesis de proteínas como la albúmina o factores de coagulación que son liberados por el hígado a la sangre. Las alteraciones en una de varias de estas funciones pueden provocar acumulación de toxinas, desequilibrios en compuestos plasmáticos, por ejemplo, aminoácidos libres y / o hipoproteinemia, con consecuencias perjudiciales para el paciente. Por lo tanto, un sistema de soporte hepático ideal cumpliría todas las tareas principales del hígado humano en términos de desintoxicación, regulación y síntesis hepática.
Además de la funcionalidad y eficacia de los sistemas de soporte hepático, deben tenerse en cuenta cuestiones de seguridad. En particular, los sistemas utilizados para apoyar la función hepática en el hígado enfermo deben ser estables durante el período de tratamiento y mostrar funciones reproducibles para garantizar una calidad estandarizada. Además, se exige la investigación de la biocompatibilidad de los materiales utilizados y la prevención de la infección de los pacientes para garantizar la seguridad clínica de los tratamientos.
Sistemas de soporte hepático artificial
Los sistemas de soporte hepático artificial están destinados a eliminar las toxinas de la sangre de los pacientes con insuficiencia hepática mediante técnicas de adsorción mecánicas y / o químicas. Para proporcionar una desintoxicación eficaz, la mayoría de estos sistemas se basan en la desintoxicación del plasma del paciente con adsorbentes, tipo diálisis, utilizando carbón activado suspendido en el dializado para la adsorción de toxinas, o albúmina proporcionada en el líquido de diálisis como eliminador fisiológico de compuestos lipofílicos. El sistema de recirculación de adsorbente molecular combina la diálisis de albúmina con una columna de intercambio aniónico y de carbón, que permite el reciclaje de las moléculas de albúmina después de pasar por la columna de adsorbente. Se demostró que el sistema proporciona una eliminación eficaz de las toxinas plasmáticas del plasma en estudios preclínicos y clínicos. Se persigue un enfoque diferente en el dispositivo de desintoxicación de separación y adsorción de plasma fraccionado (FPSA), también conocido como sistema Prometheus, que conduce directamente el plasma a través de columnas adsorbentes sólidas para facilitar la eliminación de toxinas.
Se han publicado los resultados de varios ensayos clínicos aleatorizados de sistemas de apoyo artificial. El efecto sobre la insuficiencia hepática aguda de la diálisis con albúmina se investigó en un ensayo que incluyó a 49 pacientes tratados convencionalmente y 39 con terapia de diálisis con albúmina. Aunque se observó una tendencia hacia tasas de supervivencia más altas, no fue posible sacar conclusiones definitivas sobre la eficacia o seguridad del sistema. Estos resultados sugieren que la desintoxicación físico-química del plasma por sí sola no es suficiente para abordar la función hepática de manera que aumente la probabilidad de supervivencia. La cuestión de si la calidad de vida de los pacientes con enfermedad hepática aguda o aguda sobre crónica puede mejorarse mediante sistemas de soporte hepático artificial sigue abierta.
Biorreactores de tanque de acero inoxidable
Con la necesidad de desarrollar procesos que cumplan con las normativas, es cada vez más claro dentro de la industria de la terapia celular que los biorreactores agitados de tanques de acero inoxidable tradicionales se están pasando por alto en favor de los biorreactores de tanque agitado (SUB) de un solo uso, un tendencia alineada con la producción biofarmacéutica tradicional. Este interruptor alivia la carga reglamentaria de tener que validar los procedimientos de limpieza y esterilización y evita los grandes costos de capital e infraestructura asociados con los biorreactores de tanque agitado de acero inoxidable y su mantenimiento. También simplifica el proceso al reducir el tiempo y el costo asociados con los procedimientos de instalación y eliminación de desechos. Sin embargo, este enfoque tiene sus inconvenientes con respecto a los costos continuos de los SUB y, quizás lo que es más preocupante, la dependencia de un solo proveedor para un aspecto clave del proceso. Esta limitación tiene implicaciones con respecto tanto a la fiabilidad del suministro como a la calidad de los SUB. Cualquier problema que encuentre el proveedor con respecto al suministro de SUB, por defecto, se convierte en un problema para la empresa de terapia celular. De manera similar, será necesario una supervisión y validación estrictas para garantizar que la calidad dispositivos suministrados sea constante, ya que cualquier variación en la calidad de construcción puede tener un impacto directo en el proceso de terapia celular. Otro problema podría ser la capacidad de utilizar el protocolo de recolección descrito anteriormente en algunos SUB porque muchas de las configuraciones actualmente disponibles no podrían dar la breve ráfaga de agitación intensa requerida para separar las células. También será importante demostrar que son capaces de suspender eficazmente los microportadores con una agitación baja adecuada deseada para aumentar la densidad celular.
En la actualidad, el número de células producidas en microportadores en un biorreactor agitado en comparación con las obtenidas en la confluencia en un matraz en T sugiere que se ha logrado la confluencia en los microportadores. La densidad de siembra actual y la concentración de microportadores se basan en las condiciones de los matraces en T y en algunos estudios destinados a optimizarlas. Claramente, para obtener un mayor número de células, una mayor concentración de microportadores ayudaría, y se están realizando estudios en los que se agregan más nuevos durante el cultivo y luego se confía en la transferencia de perlas para poblarlos. Hasta la fecha, está resultando un problema no trivial. Además, a las densidades y escalas celulares actuales, se puede lograr una transferencia de oxígeno suficiente a través de la superficie superior del medio sin burbujeo.
A una cierta densidad y escala celular, probablemente se requerirá una mayor agitación y / o aireación burbujeante para satisfacer la demanda de oxígeno, nuevamente con todos los problemas de sensibilidad del cultivo celular (densidad celular y CDQ en este caso) a las tensiones dinámicas de fluidos, especialmente porque el burbujeo es potencialmente más dañino y el uso del surfactante protector.
Además del cambio hacia los SUB, también se ha centrado en el desarrollo de procesos de cultivo libres de suero y xenón. Una vez más, la razón principal que se cita a menudo para esto es el cumplimiento normativo y la necesidad de eliminar todos los componentes que contienen animales del proceso por razones de seguridad. Sin embargo, además de esto, también existen preocupaciones acerca de la variabilidad de un lote a otro asociada con el suero, que puede tener implicaciones significativas en el proceso, así como en la disponibilidad de suero y problemas de suministro. Como tal, ha habido una tendencia a reducir o eliminar el suero del proceso e incluso a desarrollar procesos completamente libres de suero y xenón.
La capacidad de realizar trabajos de desarrollo a pequeña escala permite que se lleve a cabo la optimización del proceso sin la necesidad de utilizar grandes volúmenes de reactivos o medios costosos. Hasta hace poco, la mayor parte del trabajo de desarrollo a pequeña escala, tanto para la producción biofarmacéutica tradicional como para la fabricación de terapias celulares, se realizaba en biorreactores más pequeños o matraces giratorios (generalmente 100 ml). Más recientemente, sin embargo, ha habido una afluencia de tecnologías de microbiorreactores que permiten estudios de alto rendimiento utilizando volúmenes de mililitros. Un ejemplo clave de esto es el biorreactor de microescala avanzado, que es un sistema de biorreactor automatizado de alto rendimiento que comprende hasta 48 recipientes de biorreactor de tanque agitado de 15 ml controlables individualmente con la capacidad de monitorear y controlar el pH, la temperatura y el oxígeno disuelto. Sus características físicas se han definido recientemente, y ha demostrado ser un éxito para la investigación y el desarrollo biofarmacéuticos, y el trabajo realizado por varias empresas muestra que proporciona un rendimiento de proceso similar al de los sistemas de biorreactores de tanque de acero inoxidable a gran escala.