Biorreactores continuos para cultivo de células madre atrapadas

Cuando las células madre atrapadas se cultivan en sistemas discontinuos, la fuerza impulsora para la entrada de nutrientes y la salida de metabolitos en la construcción de material que contiene las células madre disminuye continuamente. En sistemas continuos con retención de células, esta fuerza impulsora se puede mantener casi constante. Hay dos tipos generales de biorreactores que se pueden utilizar en una operación continua: mezclados “perfectamente” y de flujo pistón. Un ejemplo de un biorreactor perfectamente mezclado es un reactor de tanque agitado continuo (CSTR) con un mecanismo de retención de células, mientras que una configuración de reactor de flujo de pistón (PFR) correspondería a una construcción que contiene células, que es parte de un fluido circuito que fluye a través del material poroso que contiene las células. La configuración PFR permite que el medio fresco sea forzado dentro de la estructura porosa del andamio, creando así un flujo convectivo, que minimiza las distancias de difusión mientras se mantiene por debajo de los valores críticos de velocidad de corte. Además, este tipo de flujo es muy eficaz para sembrar las células en los andamios al comienzo del cultivo de células madre atrapadas. El trabajo de Wendt estableció una comparación entre matraces giratorios de placas de pocillos (estáticos) (agitados) y una siembra de células de condrocitos PFR (perfundida). Estos autores demostraron que el sistema PFR permitió una siembra celular significativamente más uniforme y eficiente. También se demostró que las células del estroma de la médula ósea se distribuyen de manera más uniforme en armazones cerámicos cuando se utiliza la siembra perfundida, en comparación con el control estático. Es importante recordar que las construcciones que pueden ser perfundidas por PFR son porosas, es decir, este sistema de cultivo no es apropiado para andamios de hidrogel, que tienen una permeabilidad hidráulica menor.

El principal inconveniente de los reactores PFR es la dificultad para medir y controlar el pH y el OD dentro del andamio; además, es muy difícil medir el crecimiento celular, lo que hace que la optimización de estos procesos sea mayoritariamente empírica. Estos problemas pueden minimizarse teniendo tiempos de residencia bajos (1 – 10 s) del medio de cultivo en el armazón y monitoreando los parámetros en la salida mientras se aplica el control en la entrada. El requisito de tener tiempos de residencia bajos en el PFR implica que la longitud de la construcción perfundida por el medio de cultivo se mantiene dentro de la escala milimétrica, lo que hace que el sistema sea difícil de escalar. La mayoría de los sistemas PFR utilizados en cultivos de células madre atrapadas tienen una recirculación media en un depósito, lo que aumenta el tiempo de residencia general de todo el sistema a varios días, es decir, cerca de los niveles de CSTR. Por lo tanto, mientras que la transferencia de masa en la construcción es convectiva, el medio de cultivo total utilizado se mantiene al mismo costo que un CSTR. En general, los sistemas PFR no se pueden ampliar a escala, pero proporcionan las condiciones adecuadas para sembrar y cultivar células madre atrapadas para un producto terapéutico autólogo. De hecho, la falta de sensores en cualquier sistema de procesamiento cerrado simplifica el problema regulatorio ya que para cada sensor hay un modo de falla asociado, o riesgo, que necesita ser mitigado. Por estas razones, la principal aplicación terapéutica de este reactor continuo ha sido la ingeniería de tejido óseo autólogo.

Los reactores continuos de tanque agitado, a diferencia de los PFR, tienen tiempos de residencia más altos (1 a 4 días) y la transferencia de masa dentro del material es difusional, lo que limita el tamaño de los andamios a cientos de micrómetros para minimizar el dC ∕ gradientes. Por el contrario, es posible tomar muestras del caldo de cultivo y así medir el crecimiento celular y la composición del medio de cultivo. La medición y el control de pH y OD se realizan en el caldo de cultivo que se mezcla homogéneamente, es decir, se conoce el OD y el pH en las proximidades del armazón. Otra ventaja del CSTR en comparación con los PFR es su escalabilidad. Al considerar las terapias celulares alogénicas, donde la escalabilidad permite el establecimiento de economías de escala, un CSTR tiende a ser la opción más apropiada para obtener un gran número de células bajo un sistema controlado. El grupo Zandstra de la Universidad de Toronto ha demostrado que un CSTR evita la fluctuación de la composición del medio de cultivo entre intercambios de medio discretos en la expansión de mESC encapsulada en alginato; Una ventaja que a menudo se pasa por alto de los sistemas continuos sobre los intercambios de medios discretos es que evita las tensiones del proceso, como interrumpir la agitación, para permitir que las construcciones se asienten antes de reemplazar el medio.

Uno de los aspectos más difíciles al comparar el rendimiento de diferentes configuraciones de reactores es el acoplamiento entre la transferencia de masa y el tiempo de residencia. En un PFR, la transferencia de masa y el tiempo de residencia están acoplados porque la tasa de flujo del medio de cultivo (o la velocidad superficial = tasa de flujo ∕ área del andamio) proporciona tanto el intercambio de medios como el transporte de masa convectivo. En un CSTR, la transferencia de masa se desacopla del tiempo de residencia porque la rotación del impulsor proporciona la transferencia de masa, mientras que la tasa de flujo de perfusión proporciona el tiempo de residencia (o tasa de reemplazo media). Teniendo en cuenta este tema, algunos autores han comparado el efecto de los diferentes mecanismos de transferencia de masa en un reactor de tipo PFR, un recipiente de tanque agitado, un recipiente de pared giratoria y un reactor biaxial (BXR) con el mismo tiempo de residencia entre los cuatro reactores para humanos cultivo de MSC fetal en un andamio de policaprolactona-fosfato tricálcico (PCL-TCP). Los resultados mostraron que el BXR produjo más células a una tasa de crecimiento más rápida con más formación de hueso ectópico en ratones inmunodeficientes en comparación con los otros tres tipos de reactores. Curiosamente, los autores también han notado la presencia de «orificios de perfusión» en el reactor PFR, lo que plantea la hipótesis de que el andamio podría degradarse mecánicamente por el flujo de fluido en este tipo de reactor. Se había demostrado anteriormente que el BXR mejora el flujo de fluido dentro de los andamios de 20 a 40 veces, debido a su movimiento bidireccional, mientras mantiene los niveles de esfuerzo cortante por debajo de 2 Pa y es una de las innovaciones más recientes en el campo de los biorreactores continuos.

Muchos de los principios del bioprocesamiento de proteínas recombinantes han sido adoptados por el incipiente campo del bioprocesamiento de células madre; en la producción de proteínas recombinantes, cuando las células se cultivan en un biorreactor continuo con retención celular, cuanto mayor es el flujo, mayor es el crecimiento de las células, ya que el objetivo principal es eliminar los metabolitos y agregar nutrientes al cultivo celular; típicamente, la tasa de flujo de perfusión solo está limitada por las tensiones adicionales del proceso que se originan en el mecanismo de retención celular o la dilución del producto secretado. En el bioprocesamiento de células madre atrapadas, aunque todavía es necesario agregar nutrientes y eliminar metabolitos, también puede ser importante retener factores solubles o proteínas ECM que son producidas por las células que tienen un efecto positivo en el tipo de célula final deseado. Esta idea ha sido demostrada por Junho y Ma mediante la construcción de un sistema de biorreactor donde un andamio poroso de tereftalato de polietileno (PET) sembrado con hMSC se cultivó con medio perfundido a través del andamio o tangencialmente a él, proporcionando así una transferencia de masa por convección o difusión en el interior el andamio, respectivamente. Al comparar estos sistemas entre sí, se encontró que el sistema de perfusión tangencial favorecía la expansión de hMSC indiferenciadas, mientras que el cultivo de perfusión de flujo continuo estaba enriquecido en marcadores osteogénicos como BMP-2, ALP y RUNX2. Los autores han correlacionado aún más este destino celular diferencial con un aumento en las proteínas ECM fibronectina, vitronectina y colágeno tipo I en el flujo tangencial. Por tanto, para diferentes destinos celulares, las limitaciones de difusión de la transferencia de masa pueden ser beneficiosas o perjudiciales.