En cuanto a las Células Madre Pluripotentes Humanas, antes de la diferenciación de las células madre embrionarias humanas (CEEh), las CEEh no diferenciadas y dependientes de alimentadoras se cultivan en condiciones libres de alimentadoras y químicamente definidas con el uso del medio TeSR™-E8™ en placas recubiertas con Matrigel Matrix HESC-qualified (Bio-Coat). Podemos omitir este paso si las CEEh se mantienen en medio TeSR™-E8™. Las siguientes instrucciones son las que se utilizan en los experimentos.
Antes de descongelar o pasar las CEEh, recubrir una nueva placa de 6 pocillos con una solución de Matrigel Matrix, y preincubar a temperatura ambiente (25 °C) durante al menos 1 h antes de usar.
- Retirar la solución de Matrigel Matrix con una pipeta o por aspiración.
- Añadir 2 mL de medio TeSR™-E8™ a la placa de 6 pocillos.
- Colocar la mezcla de agregados celulares pequeños (500–1000 agregados/pocillo) en la placa de 6 pocillos que contiene TeSR™-E8™ y observar el estado de los agregados celulares bajo el microscopio para asegurar la densidad celular deseada.
- Colocar la placa de 6 pocillos en una incubadora de CO₂ a 37 °C. Mover la placa con movimientos hacia adelante y atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente los pequeños agregados celulares.
- Cambiar el medio diariamente con TeSR™-E8™ y monitorear el crecimiento celular a diario hasta el siguiente pasaje o la diferenciación celular.
Antes de la inducción del mesodermo, recubrir cada matraz T12.5 con 1.5 mL de Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix diluido a temperatura ambiente durante 30 min y luego incubar los matraces a 37 °C durante otros 30 min.
- En el momento del pasaje celular, digerir las colonias de células de células madre pluripotentes humanas (CPHh) en pequeños agregados celulares con ReLeSR™ a 37 °C durante unos 3 min.
- Detener la digestión con TeSR™-E8™ en el biorreactor, golpear suavemente la placa de cultivo para asegurarse de que los pequeños agregados celulares se desprendan del fondo de la placa.
- Recolectar los agregados celulares en un tubo de centrífuga de 15 mL y pipetear la suspensión de agregados celulares suavemente hacia arriba y hacia abajo unas 3–5 veces para ajustar el tamaño de los agregados a 100–200 células/agregado.
- Centrifugar los agregados recolectados a 500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante del tubo de centrífuga de 15 mL y resuspender los pequeños agregados celulares en 2 mL de TeSR™-E8™.
- Retirar el líquido de los matraces T12.5 recubiertos con Corning y añadir 2 mL de TeSR™-E8™ al matraz.
- Sembrar los agregados celulares en el matraz T12.5 recubierto con Matrigel de Corning a una densidad de aproximadamente 100 agregados/cm2 en TeSR™-E8™.
- Colocar los matraces en la incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad) y agitar los matraces con varios movimientos rápidos de lado a lado y de adelante hacia atrás para distribuir uniformemente los agregados.
- Verificar el estado de crecimiento de las colonias celulares al segundo día; si el tamaño de las colonias supera los 300 μm, deberían estar listas para ser cambiadas al medio de diferenciación.
- Aspirar el medio del matraz T12.5 y añadir 5 mL de medio de inducción del mesodermo, colocar los matraces en una incubadora para cultivar durante 2 días.
- Después de 2 días de cultivo en medio de inducción del mesodermo, hemos observado que casi todas las colonias exhiben una apariencia de colonia suelta y una morfología celular alargada, y dan lugar a células diferenciadas Brachyury.
Después de 2 días de inducción del mesodermo, las células de células madre prrrrrrrrr pluripotentes se cultivan adicionalmente cambiando al medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico. Algunos de los matraces T12.5 con células inducidas a mesodermo se colocan en el rotador de accionamiento biaxial. Los matraces T12.5 y el rotador de accionamiento biaxial se colocan en la incubadora de CO₂ para el cultivo celular.
- Aspirar el medio de inducción del mesodermo y añadir 30 mL de medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico a los matraces T12.5 del grupo RPM y añadir 5 mL de medio a los matraces T12.5 del grupo de control (ver Nota 5).
- Poner los matraces T12.5 del grupo RPM en el rotador de accionamiento biaxial.
- Colocar el rotador de accionamiento biaxial con los matraces T12.5 y los matraces T12.5 del grupo de control en la incubadora de CO₂ a 37 °C con 5% de CO2 y 95% de humedad para la inoculación y cultivo celular.
- Encender el sistema de control electrónico y configurarlo en modelos de velocidad aleatoria (0.1–10 rpm).
- Cambiar la mitad del volumen del medio por medio fresco de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico cada dos días.
- Después de 3 días de cultivo de células madre pluripotentes en medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico, en el grupo RPM surgieron células con morfología endotelial y estructuras tubulares. Algunas células diferenciadas contenían células redondas con cúmulos «en forma de uva». Las células diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD31 y CD34.