La tecnología de expansión de células madre en biorreactores de tanque agitado permite la expansión de células de mamífero, lo que puede traducirse en procesos compatibles con las regulaciones de las Buenas Prácticas de Manufactura actuales (cGMP). Las células se introducen en el recipiente del biorreactor, donde los parámetros clave como la temperatura, el pH y los niveles de oxígeno se controlan estrictamente para facilitar el crecimiento a lo largo del tiempo. Aquí, describimos la expansión de células madre pluripotentes humanas basada en microportadores en un biorreactor de tanque agitado de 3 L.
La tecnología de células madr células madre en biorreactores ha avanzado rápidamente desde su desarrollo y continúa revolucionando la medicina personalizada, el desarrollo de fármacos y el modelado de enfermedades. Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) pueden diferenciarse, dando lugar a tipos de células clínicamente relevantes como cardiomiocitos y neuronas. Dado que tienen una promesa notable para el desarrollo de terapias curativas, se ha prestado una atención considerable a la expansión a gran escala de estas invaluables células.
La expansión de hPSC requerida para terapias basadas en células utilizando biorreactores aborda las limitaciones clave de los métodos de cultivo 2D convencionales. El cultivo de estas células madre en biorreactores en superficies de vidrio o plástico es un proceso ubicuo en laboratorios académicos e industriales. Sin embargo, la comprensión continua de la biología celular y las mejoras de los métodos respaldan la aplicación de métodos de cultivo 3D. Los métodos de cultivo 3D representan con mayor precisión el microambiente celular que se encuentra in vivo, y las células cultivadas en estos sistemas responden en consecuencia.
Los estudios de desarrollo de fármacos han demostrado diferencias claras en las respuestas de las células cultivadas en 2D frente a 3D, lo que subraya la necesidad de recapitular microambientes celulares complejos para obtener respuestas precisas a los candidatos terapéuticos. Otra limitación crítica de los sistemas de cultivo 2D es la escalabilidad.
Por ejemplo, se requerirán aproximadamente 1×108−1×109 cardiomiocitos derivados de hPSC para reemplazar el considerable número de células perdidas en un infarto de miocardio. Para ello, los biorreactores proporcionan un método robusto, eficiente y escalable para generar un suministro ilimitado de células críticas en muchas indicaciones clínicas.
Aquí, describimos la expansión de hPSC basada en microportadores en un biorreactor de 3 L, lo que resulta en una expansión de alto rendimiento de células madre en biorreactores de alta calidad en 2 semanas de cultivo. El inóculo celular, derivado de células cultivadas en 2D, se introduce en el biorreactor con microportadores de plástico recubiertos de matriz extracelular. En comparación con los cultivos en suspensión que utilizan un método basado en agregados para la expansión, los microportadores proporcionan una gran superficie en la que las células madre en biorreactores se adhieren y crecen.
Se deben realizar los procedimientos utilizando técnica aséptica dentro de una cabina de seguridad biológica a menos que se indique lo contrario. Es necesario limitar la exposición del sistema de cultivo de hPSC L7™ a la luz. Se deben almacenar los reactivos según las instrucciones del fabricante.
- Descongele una botella de 10 mL de suplemento de medio hPSC L7™ a 37 °C. Agregue todo el contenido a 1 L de medio basal hPSC L7™ TFO2 (ver Nota 1). Invierta la botella dos veces para mezclar y almacene a 4 °C hasta su uso.
- Bolsas de 7 L de medio basal hPSC L7™ TFO2 (ver Nota 2).
- Solución de pasaje de hPSC L7™ (ver Nota 3).
- Solución de pasaje de hPSC F3 (ver Nota 4).
- Agua de grado para cultivo celular.
- Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con calcio y magnesio (DPBS+/+); pH 7-7,6. Almacenar a 15-30 °C.
- Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (DPBS-/-); pH 7-7,6. Almacenar a 15-30 °C.
- 250 μg/mL de matriz hPSC L7™. Agregue 4 mL de agua de grado para cultivo celular a 1 mg de matriz liofilizada (ver Nota 5).
- 10 mM Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho (ROCK)). Agregue 624,4 μL de DMSO a 2 mg de inhibidor de ROCK. Mezcle con pipeta.
Ensamblar el tubo de inmersión/línea de perfusión, la línea de alimentación de medios y el conjunto de extensión de la línea de recolección.
Autoclavar usando el ciclo seco.
Es iimportante realizar los procedimientos utilizando técnica aséptica dentro de una cabina de seguridad biológica a menos que se indique lo contrario y limite la exposición del sistema de cultivo de hPSC L7™ a la luz. Para mantener un ambiente estéril dentro del recipiente del biorreactor y las bolsas de medios de cultivo celular, es necesario desbloquear las tuberías solo cuando introduzca reactivos, medios o inóculo celular o extraiga muestras. Inmediatamente selle la línea y vuelva a bloquear la tubería cuando termine.