Para una mayor inducción de células progenitoras hematopoyéticas, las células se cultivan en medio para células progenitoras hematopoyéticas durante otros 3 a 5 días.
Apague el sistema de control electrónico en los biorreactores y retire con cuidado los frascos T12.5 del rotador de accionamiento biaxial.
Aspire el medio de diferenciación de células progenitoras del endotelio hemogénico y añada unos 30 mL de medio para células progenitoras hematopoyéticas en los frascos T12.5 del grupo RPM.
Coloque los frascos T12.5 en el rotador de accionamiento biaxial y vuélvalos a introducir en la incubadora de CO2 durante 3 días más de cultivo celular.
Cambie el medio con medio fresco para células progenitoras hematopoyéticas de medio volumen cada dos días.
Después de 3 días de cultivo en medio para células progenitoras hematopoyéticas, se forman muchos cúmulos con forma de uva y muchas células redondas flotan en el medio. Las células progenitoras hematopoyéticas diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD34 y CD43.
En el día 2, 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recogen y se preparan para la inmunotinción.
Retire el medio de los frascos y añada PBS a las células para lavarlas 1 o 2 veces.
Aspire el PBS y luego fije con una solución de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.
Lave las células una vez con PBS y la base de los frascos se divide en pequeños trozos (de 1 cm x 1 cm) con cuchillas afiladas.
Coloque cada pequeño trozo que contenga células en un plato de cultivo celular de 24 pocillos y añada PBS al pocillo.
Permeabilice las células durante 20 minutos con Triton X-100 al 0.2% y suero de burro al 1% a temperatura ambiente (ver Nota 7).
Lave las células dos veces con PBS y añada la solución bloqueante de suero de burro al 5% al pocillo para un bloqueo de 1 hora a 37 °C.
Prepare el anticuerpo primario en suero de burro al 5% en las diluciones recomendadas por el fabricante.
Incube las células en la solución de anticuerpo primario durante toda la noche a 4 °C (o 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes).
Lave las células tres veces con PBS para reducir el fondo fluorescente.
Prepare la solución mezclada que contiene el segundo anticuerpo (diluciones 1:200) y Hoechst 33342 (0.1–1 μg/mL) en PBS con suero de burro al 5%.
Incube las células en la solución mezclada durante 1 hora a temperatura ambiente.
Lave las células dos veces durante 5 minutos en PBS.
Ponga una gota de medio de montaje, añada un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas.
Observe las láminas y adquiera la imagen bajo el microscopio confocal.
Preparación para Inmunotinción (Días 5 y 8)
En el día 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recolectan y se preparan para la inmunotinción.
Disocie las células en células individuales con tripsina al 0.05% y EDTA al 0.1%.
Añada solución inhibidora de tripsina y centrifuge durante 5 minutos a 500 g y 4 °C y deseche el sobrenadante.
Lave las células con tampón de lavado celular (PBS que contiene BSA al 5%).
Cuente las células y resuspéndalas en BSA al 5% en PBS a 1×106 células/mL.
Transfiera 50 μL de suspensión celular a tubos de ensayo.
Añada los anticuerpos primarios purificados y conjugados con fluorescencia diluidos (CD31, CD34 y CD43) a los tubos de ensayo en las diluciones recomendadas por el fabricante. Los controles incluyen: negativo (sin tinción añadida), control de isotipo (con anticuerpo primario no específico etiquetado de manera similar).
Incube en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
Lave cada muestra tres veces con 2 mL de tampón de lavado celular, centrifugue a 500 g durante 5 minutos a 4 °C.
Añada 500 μL de PBS a cada pellet y resuspenda la muestra celular.
Examine las muestras celulares usando el citómetro de flujo FACS Calibur (BD).
Analice los datos con el software FlowJo, versión 10.0.7.
Notas Adicionales
Si no se va a usar inmediatamente, la placa de cultivo recubierta debe sellarse con parafilm para evitar la evaporación de la solución de Matrigel® y las placas se pueden almacenar a 2–8 °C hasta por 1 semana después del recubrimiento.
Cuando la disociación celular dure aproximadamente 2 minutos en la incubadora, debe verificar el estado de las células para asegurarse de que las colonias estén sueltas y se desprendan del fondo del plato o frasco. No digiera en exceso las células para generar una suspensión de células individuales.
Resuspenda suavemente el pellet celular con una pipeta para evitar generar una suspensión de células individuales. El tamaño de los agregados celulares se puede ajustar alterando el número de veces que la mezcla de agregados celulares se pipetea hacia arriba y hacia abajo. Tenga cuidado de mantener las células como agregados.
Siembre los agregados celulares a una densidad óptima en el frasco (aproximadamente 100 agregados/cm²). No siembre demasiado denso ni demasiado disperso.
El frasco debe llenarse con un medio de cultivo celular y asegúrese de que la burbuja se extraiga en el grupo RPM.
La alimentación del sistema de control electrónico debe apagarse al preparar el cambio del medio celular.
Este paso se puede omitir cuando se tiñen las células con anticuerpos CD31, CD34 o CD43.