Los métodos de estado estacionario en biorreactores se basan en una reacción química o bioquímica que ocurre en el líquido, el cual actúa como absorbente de oxígeno. El método de estado estacionario se basa en el flujo de oxígeno y la diferencia entre la concentración de O2 de entrada y la concentración de O2 de salida. Este enfoque permite que el kLa cambie con el tiempo con una reducción en la concentración de oxígeno. En otras palabras, este método utiliza el balance global de oxígeno en la fase gaseosa del reactor. Pueden ocurrir errores notables debido a la pequeña diferencia en la concentración de O2 entre las corrientes de gas de entrada y salida.
El kLa es una medida del uso de oxígeno en sistemas gas-líquido. El valor de kLa es muy importante en la síntesis de productos y biomasa, ya que la obtención metabólica de energía está relacionada con el oxígeno producido por los sistemas de ventilación. Muchas variables son efectivas en el valor de kLa, también conocido como eficiencia de aireación. Estos parámetros son principalmente: turbulencia en el tanque de ventilación, es decir, mezclado, presión del aire, caudal de aire, temperatura, propiedades del fluido (densidad, viscosidad, etc.) y la disponibilidad de inhibidores de espuma.
Para este protocolo de estado estacionario en biorreactores, el tipo de biorreactor elegido es un reactor de tanque agitado con dos deflectores. La capacidad del STR es de 3 L con un volumen de trabajo de 2 L.
- Esparcidor: Tipo orificio.
- Impulsor: Turbina Rushton de 6 aspas.
- Bomba de aire: Usar con tubos de silicona.
- Sonda de oxígeno disuelto: Tipo polarográfico.
- Detector de temperatura.
- Puerto de muestreo.
- Unidad de control del biorreactor: Monitorea la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto, la aireación (caudal de gas) y la agitación (velocidad del agitador).
- Tanque de nitrógeno: Usar y organizar con regulador de presión.
Obtener el cultivo de reserva de Escherichia coli como organismo modelo para la producción aeróbica en biorreactor.
Preparar el medio de crecimiento Luria-Bertani (LB) en forma de caldo y agar para E. coli con los siguientes componentes para 1 L: 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura y agua destilada. Añadir agar-agar (2%) con estos componentes para el medio de agar.
Utilizar la concentración celular de E. coli a una longitud de onda de 600 nm.
Medir el tiempo y también obtener los valores de concentración de OD correspondientes a esos tiempos.
Instalación del Biorreactor
- Usar la forma de orificio del esparcidor de estado estacionario en biorreactores que es responsable de la entrada de burbujas de aire al biorreactor a través de la bomba de aire.
- Localizar el puerto de la turbina Rushton en el STR (ver Nota 5).
- Instalar el puerto de muestreo, el detector de temperatura y la sonda de OD de tipo polarográfico dentro del biorreactor.
- Esterilizar en autoclave el biorreactor con todas sus piezas colocadas dentro durante 20 min a 121 °C.
Preparación del Medio de Crecimiento
- Preparar medio de agar para mantener el cultivo de reserva en placas Petri o tubos inclinados. Pesar los componentes de triptona, NaCl y extracto de levadura más agar-agar según los volúmenes requeridos y mezclarlos en el agua destilada. Hervir la solución para homogeneización.
- Preparar los componentes del medio de caldo para la ampliación desde las placas Petri de agar hasta el volumen final de inoculación del biorreactor. Comenzar con volúmenes de 5 mL en tubos y continuar con volúmenes de 10, 20 y 40 mL, respectivamente. Pesar todos los componentes excepto el agar-agar y mezclarlos en el agua destilada en las cantidades requeridas.
- Preparar por separado el medio de crecimiento para el biorreactor en un volumen de 2 L.
- Medir los valores de pH de los medios de crecimiento y ajustar el pH a un rango entre 7.5 y 8.
- Esterilizar en autoclave todos los medios de crecimiento y equipos durante 20 min a 121 °C.
- Para el medio de agar: Poco después de la esterilización, verter el medio de caldo en condiciones asépticas en placas Petri/tubos estériles mientras la temperatura media es de aproximadamente 60 °C y dejar solidificar por enfriamiento.
Preparación del Microorganismo
- Inocular las células de E. coli en medio de agar con asa de inoculación en condiciones asépticas, primero. Cultivar las células a 37 °C.
- Después de que las colonias crezcan en la placa Petri, tomar una sola colonia de la placa y transferir a 5 mL de medio de caldo. Escalar hasta 40 mL de medio de caldo en un Erlenmeyer de 250 mL siguiendo el crecimiento del cultivo.
- Usar los 40 mL de cultivo para inocular el biorreactor.
Operación del STR
- Después del proceso de esterilización de estado estacionario en biorreactores, transferir el medio de crecimiento estéril al biorreactor en condiciones asépticas.
- Inocular el 2% (v/v) de las células correspondientes a 40 mL en el biorreactor en condiciones asépticas.
- Conectar la bomba de aire al cabezal del puerto del esparcidor con tubo de silicona.
- Operar el STR bajo condiciones adecuadas a 150 rpm y 1 vvm (37 °C) siguiendo las indicaciones de la unidad de control del biorreactor.
Medición del Coeficiente de Transferencia de Oxígeno: kLa
- Verificar continuamente la densidad óptica de las células para seguir el crecimiento.
- Después de que las células alcancen la fase de crecimiento logarítmico, estar listo para la determinación de kLa mediante el método dinámico en el biorreactor.
- Para la desoxigenación del caldo en ese momento, conectar el tanque de acero de nitrógeno.
- Inyectar gas nitrógeno en el biorreactor para desplazar el oxígeno.
- Usar la sonda de OD y monitorear los cambios en la concentración de OD.
- En este período, C disminuye.
- Después de observar el valor de OD como 0% de saturación (o cerca del 0%), cortar el suministro de nitrógeno.
- Después de que C disminuya, airear el caldo de fermentación mediante bombeo en condiciones de operación específicas, como un flujo de aire constante conocido.
- En función del tiempo, C aumenta. Monitorear este cambio en la concentración de OD siguiendo el inicio del flujo de aire (Fig. 1).
- Medir los valores de C en diferentes momentos en el biorreactor y registrar estos varios valores con respecto al tiempo usando un cronómetro para la gráfica.
- Asumir que la reoxigenación del caldo de fermentación es rápida en comparación con el crecimiento celular, de modo que el nivel de OD alcanzará un valor de estado estacionario en poco tiempo. C*, que es el valor de estado estacionario, muestra un equilibrio entre el suministro y el consumo de oxígeno.