Diferenciación de Alta Eficiencia de Células Madre Pluripotentes Humanas a Células Madre/Progenitoras Hematopoyéticas en Biorreactores de Máquina de Posicionamiento Aleatorio
Se sabe que las células madre pluripotentes humanas (PSC) se diferencian en casi todas las células del linaje sanguíneo in vitro y son muy prometedoras para el estudio del desarrollo hematopoyético temprano humano, además de tener un enorme potencial en el tratamiento de trastornos hematológicos. Aunque se han desarrollado varios métodos de diferenciación de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC), los rendimientos de HSPC logrados con estas estrategias aún no están disponibles para aplicaciones clínicas.
Recientemente, se han utilizado dispositivos basados en biorreactores y factores bioquímicos de forma sinérgica para inducir la diferenciación hematopoyética, mostrando un papel potencial en la hematopoyesis.
Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) incluyen células madre embrionarias humanas (ESC) y células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que tienen la capacidad de autorrenovación y pueden diferenciarse en casi todas las células del linaje sanguíneo, ofreciendo así un modelo invaluable para diseccionar el desarrollo hematopoyético humano temprano y la producción in vitro de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) y células sanguíneas funcionales para terapias de diversas enfermedades hematológicas.
Se han desarrollado algunos protocolos de diferenciación hematopoyética dirigida in vitro a partir de hPSC; sin embargo, hasta la fecha sigue siendo un gran desafío generar HSPC con un potencial robusto de injerto multilinaje y niveles de dosis de infusión de células sanguíneas funcionales a partir de hPSC. Kaufman et al. reportaron por primera vez una estrategia para generar progenitores hematopoyéticos derivados de células madre embrionarias humanas mediante cocultivo con células estromales murinas S17, las cuales fueron capaces de formar colonias mieloides.
Además, el cocultivo de hPSC con células estromales de médula ósea OP9 o con mAGM-S3 también puede generar HSPC multilinaje. La eficiencia de diferenciación del modelo basado en cuerpos embrioides (EB) es baja debido a la heterogeneidad de los tipos de células y la falta de acceso a nutrientes de las células internas. Además, el cocultivo con células alimentadoras de ratón lleva a que las células humanas entren en contacto con células de especies extrañas, lo que puede ser perjudicial para aplicaciones terapéuticas posteriores.
También se desarrollaron diferenciaciones hematopoyéticas a partir de hPSC en sistemas químicamente definidos, pero a menudo implican el cultivo en medios especializados y muchas etapas de la diferenciación, lo que hace que el costo de las HPSC sea muy elevado y dificulta la producción de HPSC a gran escala. Para promover la diferenciación hematopoyética de hPSC, se investigó el uso adecuado de factores de crecimiento y citocinas para beneficiar la producción de HSPC.
Kennedy et al. informaron que la inhibición de la vía Nodal/Activina durante la hematopoyesis de ESC humanas en un medio químicamente definido que contiene SB-431542, puede inducir el desarrollo de HSPC definitivas y bloqueó el proceso de hematopoyesis primitiva.
También se sabe que la vía canónica Wnt desempeña un papel vital en la inducción de HPSC definitivas derivadas de ESC humanas. El tratamiento de ESC humanas con el inhibidor de GSK-3 CHIR99021 mediante la activación de la señalización canónica Wnt puede promover la hematopoyesis definitiva e inhibir el número de HSPC primitivas. En contraste, el tratamiento de ESC humanas con el antagonista de Wnt IWP2 aumentó el número de HSPC primitivas.
En línea con este estudio, Wang et al. informaron que R-spondin2 desempeña un papel clave en la diferenciación hematopoyética temprana de hPSC que aumentó la generación de células mesodérmicas APLNR+ al activar la señalización TGF beta.
En otro enfoque, la expresión ectópica de factores de transcripción promueve el compromiso hematopoyético de hPSC al aumentar la expresión de mesodermo, endotelio hemogénico y los genes asociados con el desarrollo hematopoyético. Ran et al. demostraron que la expresión de RUNX1a endógeno promueve el compromiso del linaje hematopoyético a partir de hPSC y mejoró la hematopoyesis definitiva.
También se ha demostrado que la expresión ectópica de HOXA9 aumentó el compromiso hematopoyético de ESC humanas; sin embargo, HOXA9 no fue suficiente para conferir un potencial de injerto a largo plazo in vivo. Curiosamente, un estudio reciente informó que la supresión de MSX2 mejora la diferenciación hematopoyética de hPSC a través de la inhibición de la señalización TGF beta.
Trabajos recientes han indicado la importancia del entorno físico local (como el flujo sanguíneo, la tensión de cizallamiento de la pared) en la regulación de la especificación de HE y la producción de HSPC. Para imitar el microambiente físico, se han aplicado algunas técnicas de bioingeniería que promueven la hematopoyesis a partir de hPSC.
Además, la combinación de biorreactores y factores químicos podría promover aún más la hematopoyesis. En la siguiente sección, describimos un protocolo para usar el biorreactor de máquina de posicionamiento aleatorio (RPM) para cultivar hPSC y la producción a gran escala de HSPC en un sistema químicamente definido. Identificamos las características de las células y analizamos la eficiencia de la diferenciación hematopoyética en el biorreactor RPM mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo.